牛至、香茅、丁香精油化學成分及體外抑菌活性研究

牛彪，金川，梁劍平，尚若鋒，郝寶成，王學紅，楊珍，劉宇，*

（1.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，農業部獸用藥物創制重點實驗室，甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅蘭州730050；2.定西市安定區畜牧獸醫局白碌畜牧獸醫站，甘肅定西743026）

近年來，細菌耐藥性及藥物殘留的日益加重，嚴重影響著食品安全及人類健康，已成為全球性話題。植物精油（plant essential oil）是存在于植物中的一類具有芳香氣味、可隨水蒸氣蒸餾出來而又與水不相混溶的揮發性油狀成分的總稱，是天然植物和香料的精華，是植物的次生代謝產物[1]。全球精油品種3000 種以上[2]，具有商業價值的多達數百種。植物精油具有很強的廣譜抑菌殺菌、抗氧化、抗炎癥和促生長的作用[3-6]，此外，精油在腸道菌群平衡調節、新型飼料添加劑產品的研發、養殖場環境控制等方面具有可期待性[7]。近年來，越來越多的研究人員從天然植物中尋找抗生素替代品，使得植物精油有望成為一種可緩解全球抗菌藥物危機的天然抗菌劑[8-10]，得到了廣大科研工作者的青睞。植物精油對常見微生物的殺滅性及在獸藥耐藥性及殘留方面均比化學藥品有顯著的優越性，具有廣泛的開發利用前景。本文主要通過測定常見3 種植物精油及其有效成分對常見病原微生物的體外抑菌活性，分析其化學成分，為植物精油在基礎獸藥產品中的研究開發提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

HF-safe 生物安全柜：上海力申科學儀器有限公司；HNYC-202T 恒溫培養振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；Agilent 6890/5973 氣相質譜儀：美國安捷倫科技公司；BS-90-D 培養皿：蘭州博樂知生物科技有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫療器械廠。

1.1.2 菌株

埃希氏大腸桿菌（Escherichia coli，CICC10389）、白色念珠菌（Candida albicans，CICC1965）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，CICC10384）、白色葡萄球菌（Staphyloccocus albus，CICC10897）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，CICC10419）：中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所農業部獸用藥物創制重點實驗室和甘肅省新獸藥工程重點實驗室。

1.1.3 主要試劑

牛至、香茅、丁香精油：廣州花神生物科技有限公司；改良馬丁瓊脂培養基、改良馬丁培養基：海博生物科技有限公司；營養肉湯（nutrient broth，NB）、MH（A）培養基、MH（B）培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：萊陽化工實驗廠；正己烷（色譜級）：天津市科密歐化學試劑有限公司；濾紙片（d=6 mm）：甘肅省新獸藥工程重點實驗室自制，經121 ℃高壓風干后待用。其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備

將低溫斜面保存的菌種先置于25 ℃左右約0.5 h后，用接種環劃線將白色念珠菌接種至改良馬丁瓊脂培養基，置于28 ℃恒溫培養箱培養48 h，將其余4 種菌株接種至MH（A）培養基于37 ℃恒溫培養箱培養24 h，從上述培養基上挑取單菌落用無菌生理鹽水稀釋至0.5 麥氏單位的菌懸液（1 CFU/mL～5×108CFU/mL），用倍比稀釋法稀釋至所需濃度（1 CFU/mL～5×106CFU/mL）[11]，備用。

1.2.2 抑菌圈直徑的測定

取菌懸液150 μL，用涂布棒均勻涂于平板中，用無菌鑷子夾取濾紙片于培養基表面，采取3 個試驗組和1 個陰性對照組，使得各濾紙片間距離相等。然后在試驗組濾紙片上加上5 μL 精油，陰性對照組加入5 μL無菌生理鹽水，緩慢蓋住平皿，白色念珠菌28 ℃培養48 h，其余細菌放在37 ℃恒溫培養24 h，用游標卡尺測以上精油對上述病原菌的抑菌圈直徑[12]。

1.2.3 最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定

由于植物精油與培養液不相溶，采用DMSO 為助溶劑，根據文獻顯示[13]：DMSO/植物精油=1 ∶19 的體積比時DMSO 對待測試菌的生長無影響。將其稱為精油乳劑。按上述比例各先配制牛至精油乳劑5 mL，然后采用肉湯稀釋法及點種法來測定MIC 及MBC，具體為取一系列試管，分別標號1，…，10，將已滅菌試管每排9 支分別編號 1，2，…9 號，排成 5 排于超凈臺，向前 4排每支試管中加入1 mL MH（B）液體培養基，第5 排每支試管中加入1 mL 改良馬丁培養基，分別吸取牛至精油乳劑1 mL 于5 排中的第1 號試管，連續吹打混勻后采用倍比稀釋法取1 mL 至每排中第2～6 號試管制成不同濃度的牛至精油乳劑，再向其中每支試管中加入3.8 mL 相對應的液體培養基，每一排對應一個菌種并依次標注，然后取200 μL 菌懸液于相應的試管中。因此，每排前6 號試管中含有的牛至精油濃度分別為9.5%、4.75%、2.375%、1.188%、0.594%、0.297%，第 7號不加乳化劑做陽性對照，8、9 號不加菌液做液體培養基及空白對照。試驗重復3 次，將前4 排試驗完的試管放入37 ℃恒溫培養振蕩器中振蕩培養24 h，第5 排試管放入28 ℃恒溫振蕩培養箱中培養48 h。到相應時間后從各試管中取200 μL 于已倒好的相應培養基，涂勻后再培養相應的時間后數菌落個數，平皿中菌落數≤5 對應的牛至精油濃度為該菌的MIC，將各試管繼續在相應的溫度下振蕩培養5 d，按上述方法接種后未出現菌落生長的最小濃度為該菌的MBC。同理，測得香茅精油、丁香精油的MBC 和MIC。

1.2.4 3 種植物精油成分分析

結合相關文獻[14-16]，并進一步優化條件：

石英毛細管柱（0.25 mm×50 m），載氣：高純氦氣，純度≥99.999%；流速1.0 mL/min；進樣量1 μL。離子源溫度 230 ℃，電離電壓：70 eV；四級桿溫度：150 ℃，保持5 min；掃描模式：全掃描；掃描范圍：50 m/z～650 m/z。

丁香精油氣相色譜（gas chromatography，GC）條件：分流進樣，分流比 100 ∶1，進樣口溫度 250 ℃，升溫程序，初始溫度 50 ℃，以 3 ℃/min 速率升至 180 ℃，以4 ℃/min 速率升至 230 ℃，保持 1 min；牛至精油氣相色譜GC 條件：分流進樣，分流比100 ∶1，進樣口溫度250 ℃，升溫程序，初始溫度 60 ℃，以 10 ℃/min 速率升至 150 ℃，以 4 ℃/min 速率升至 230 ℃，保持 1 min；香茅精油氣相色譜GC 條件：分流進樣，分流比50 ∶1，進樣口溫度250 ℃，升溫程序，初始溫度50 ℃，保持2 min，以 5 ℃/min 速率升至 200 ℃，保持 1 min，以 10 ℃/min速率升至280 ℃，保持1 min。

1.2.5 數據統計分析

對體外抑菌活性試驗，進行3 次平行，數據采用SPSS 22 以平均值（X）±標準差（SD）表示。對采集得到的質譜圖用美國國家科學技術研究所的NIST 質譜庫08 版（NIST08.L）進行匹配，根據匹配度對化合物進行定性，用峰面積歸一化法計算樣品中各成分的相對百分含量。

2 結果與分析

2.1 抑菌圈測定結果

依據美國臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）頒布的《抗微生物藥物敏感性試驗執行標準》來判斷精油對藥物的敏感性[17]，其結果見表1，陰性對照未出現抑制效果。

從表1 可知，3 種精油對S.albus 表現出中度敏感；牛至、丁香精油對E.coli 表現出中度敏感，香茅精油無抑制作用；牛至精油對P.aeruginosa 表現出低度敏感，而香茅和丁香精油無抑制作用；牛至對S.aureus 表現出很強抑制作用，為最敏感，丁香次之，香茅相對較弱，但均為中度敏感；香茅、丁香、牛至精油對S.albus有較強的抑制作用，均表現出最敏感，在三者中，香茅最強，牛至相對較弱。

表1 3 種精油抑菌圈直徑Table 1 Diameters of bacteriostasis circles of three essential oils

2.2 MIC和MBC測定結果

按照“1.2.3”的內容，得出3 種精油對5 種常見病原菌的MIC 和MBC，7 號陽性對照管出現培養液渾濁，有菌落生長，8、9 陰性對照管培養液澄清，無菌落生長。結果見表2、表3。

表2 3 種精油的最小抑菌濃度Table 2 Minimum inhibitory concentrations of three essential oils

表3 3 種精油的最小殺菌濃度Table 3 Minimum bactericidal concentration of three essential oils

從表2 和表3 看出，3 種植物精油對5 種常見病原微生物有不同程度的抑制作用。對S.albus 說，香茅精油較強，殺滅濃度在2.375%～4.75%，牛至、丁香較弱，在4.75%～9.5%之間；牛至精油對E.coli 的殺滅較其余兩者強，殺滅濃度在1.188%～2.375%之間，丁香次之，香茅精油作用較弱，大于9.5%；三者對P.aeruginosa 表現出較弱的殺滅效果，殺滅濃度均大于9.5%；對S.aureus 殺滅效果較好的為牛至、香茅精油，殺滅濃度小于1.188%，相對較弱的為丁香精油，殺滅濃度在2.375%～4.75%之間；對C.albicans 殺滅效果最好的為丁香精油，殺滅濃度在0.297%～0.594%之間，牛至精油次之，相對較弱的為香茅精油，殺滅濃度在4.75%～9.5%之間。

2.3 3種植物精油化學成分分析

2.3.1 牛至精油氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

以出峰保留時間（retention time）為橫坐標，離子豐度（abundance）為縱坐標建立精油化學成分總離子流圖（下同）牛至精油GC-MS 總離子流圖見圖1。

圖1 牛至精油化學成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow chart of chemical constituents of Origanum vulgare essential oil

由圖1 可知，共顯示出22 個峰，其中可分離鑒定出13 種化合物，占色譜總流出峰相對百分含量的99.48%，具體見表4。

牛至精油中含量由高到低的順序為雙戊烯（33.93%）、百里香酚（19.12%）、4-萜品醇（14.92%）、α-蒎烯（10.87%）、樟腦萜（7.98%）、4-甲基-1-（1-甲基乙基）-環己烯（4.13%）、萜品油烯（3.62%）、丁香酚（2.04%）、萜品烯（1.93%）、β-松油醇（0.30%），占已鑒別出化學成分的99.36%。文獻報道[18]，其較多的烯、酚類物質是發揮抑菌作用最強的活性成分，具有廣泛的研究價值。

表4 牛至精油化學成分Table 4 Chemical constituents of Origanum vulgare essential oil

2.3.2 丁香精油GC-MS 分析

丁香精油的GC-MS 化學成分總離子流圖見圖2。

共分離出15 個峰，可鑒別出12 中物質，占色譜總流出峰相對百分含量的99.71%，具體見表5。

其中丁香酚（86.54%），1-石竹烯（10.41%），丁香精油中起主要抑菌作用的為丁香酚，丁香酚成分越高，抗菌作用越高[19]。

圖2 丁香精油化學成分總離子流圖Fig.2 Total ion flow chart of chemical constituents of clove essential oil

表5 丁香精油化學成分Table 5 Chemical constituents of clove essential oil

續表5 丁香精油化學成分Continue table 5 Chemical constituents of clove essential oil

2.3.3 香茅精油GC-MS 分析

香茅精油的GC-MS 化學成分總離子流圖見圖3。

共分離出40 個峰，通過鑒定可識別出22 種化合物，占色譜總流出峰相對百分含量的86.89%，具體見表6。

圖3 香茅精油化學成分總離子流圖Fig.3 Total ion flow chart of chemical constituents of citronella essential oil

表6 香茅精油化學成分Table 6 Chemical constituents of citronella essential oil

續表6 香茅精油化學成分Continue table 6 Chemical constituents of citronella essential oil

主要由香茅醛（31.38%）、香葉醇（18.43%）、9 種烯（16.07%）、5 種醇（27.3%）及些許烷烴、酯類組成，香茅醛、香葉醇已被證實有較強的抑菌效果[20]。

3 結論

3 種植物精油對5 種常見病原微生物均有一定程度的抑菌作用，與傳統的化學藥物殺菌劑相比，天然植物精油具有廣譜抑菌效果、毒性小、利用率高的優勢，逐漸受到越來越多研究者的關注。在“禁抗、限抗”的新時代背景下，植物精油滿足社會的需求，將植物精油用于食品，其防腐作用能有效的提高食品質量，促進食品安全。植物精油含有的各種生物活性成分將成為新型藥物研發不可或缺的一部分，但由于植物精油提取率相對較低，導致價格相對較高，并且植物精油質量是確保精油發揮臨床療效及安全的重要基礎，是制約精油類制劑研發的關鍵所在。因此，植物精油類制劑的研發在我國還處于萌芽階段。在響應社會需求的前提下，期待越來越多的精油類制劑問世，來遏制日益嚴重的細菌耐藥性及獸藥殘留，進而促進食品安全。