板栗葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性

李鋼，彭飛，尹洪洋，杜彬，李曉菁，牛奎，解瑩，楊越冬，*

（1.河北科技師范學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島066004；2.河北省天然活性成分與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島066004）

板栗在我國栽培歷史悠久，品種資源豐富，地域分布遼闊。我國板栗產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的3/4，為世界之最[1]。栗仁中富含淀粉、可溶性糖、維生素C 及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[2]，具有益氣補(bǔ)脾，補(bǔ)腎強(qiáng)筋等功效。長期以來，栗仁的開發(fā)一直受到廣泛的關(guān)注，但對(duì)于栗葉成分及活性功能的研究較少，使其大部分成為廢棄物，造成了資源的巨大浪費(fèi)。

《福建藥物志》載板栗葉具有清肺止咳，解毒消腫之功效。在民間常用于百日咳、肺結(jié)核、咽喉腫痛、腫毒、漆瘡的治療。《中藥大辭典》記載栗葉可用于治療反胃、便血。可“治喉療火毒”、“為收斂劑，外用涂漆瘡”，是民間常用中草藥[3]。Cassandra Quave 等[4]從歐洲板栗葉乙酸乙酯層萃取物中通過高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)得94 種化合物，大多數(shù)為五環(huán)三萜派生物和齊墩果烯類以及苯酚類化合物。柏宏偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)板栗葉中含有游離鞣花酸，含量為1.669 mg/g。經(jīng)研究歐洲栗葉具有顯著的抗菌活性，可以用來制備化妝品[6]，也可用于治療地中海皮膚炎癥[7]。目前研究多集中于歐洲板栗葉，對(duì)于我國最具代表性的燕山板栗葉的研究鮮有報(bào)道。

植物葉片中總黃酮的提取方法有多種，包括傳統(tǒng)的溶劑提取法以及新興的提取技術(shù)，如微波輔助提取、超聲輔助提取等[8-9]。這些新興的提取技術(shù)不僅縮短提取時(shí)間，減少有毒試劑用量，而且顯著提高提取率。作為一種先進(jìn)的環(huán)境友好型的提取方法，加壓溶劑提取法是指在閉容器內(nèi)于高溫（50 ℃～200 ℃）和高壓（500 Pa～3 000 Pa）條件下，在短時(shí)間內(nèi)，用有機(jī)溶劑提取固體或半固體樣品的一種新型樣品前處理方法[10]。與傳統(tǒng)溶劑提取方法相比，加壓溶劑提取法可顯著縮短提取時(shí)間并提高提取效率[11]，廣泛用于糧食和谷物中的酚類化合物的提取[12-14]。

響應(yīng)面法是利用多元二次回歸方程擬合各影響因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過分析回歸方程得到最佳工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計(jì)方法[15-17]。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面對(duì)板栗葉總黃酮加壓溶劑提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并考察板栗葉黃酮的抗氧化活性，以期為板栗葉資源的開發(fā)利用奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

板栗葉：河北科技師范學(xué)院園藝科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)站，陰干處理，用研磨機(jī)粉碎，過60 目篩，收集板栗葉干粉末。

1.2 試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、總抗氧化能力試劑盒、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2-diazo-bis（3-ethyl-benzothiazole-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS） 試劑盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；2，6-二叔丁基對(duì)甲酚（2，6-Di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司。

ME 型分析天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；APLE-3000 型快速溶劑萃取儀：北京吉天儀器有限公司；UV-5500 型紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；GZX-9240 MBE 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SPECTRA MAX 190型酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了優(yōu)化板栗葉總黃酮的提取條件，將影響快速溶劑提取率的幾個(gè)條件（循環(huán)次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)）進(jìn)行單因素測(cè)試，對(duì)4 g 樣品進(jìn)行提取，研究某一因素的影響時(shí)，將其他因素保持一定值。編碼水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平編碼設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels code design of response surface experiment

以Box-behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)為基礎(chǔ)建立響應(yīng)面提取工藝，建立4 因素3 水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)量由公式（1）確定。

式中：k 為影響因子數(shù)量；C0為水平數(shù)量。

以Y（總黃酮的提取率）為響應(yīng)值，建立提取工藝參數(shù)的二次回歸模型。A、B、C、D 分別表示循環(huán)次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)。

式中：X0是常數(shù)；X1、X2、X3、X4是一次項(xiàng)系數(shù)；X5、X6、X7、X8、X9、X10是交叉項(xiàng)系數(shù)；X11、X12、X13、X14是二次項(xiàng)系數(shù)。

1.4 提取過程

稱取4 g 板栗葉干粉，與4 g 硅藻土混合均勻，加到萃取池中，萃取池剩余空間由硅藻土填充，將萃取池放入快速溶劑萃取儀進(jìn)行提取，設(shè)定提取壓力為10 MPa。固定其他條件，分別考察循環(huán)次數(shù)（1 次～3 次）、提取溫度（40 ℃～80 ℃）、提取時(shí)間（3 min～11 min）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（10%～90%）對(duì)提取板栗葉總黃酮的影響。

1.5 總黃酮提取率的計(jì)算

分別量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 10 mL 容量瓶中。吸取 0.3 mL 5%NaNO2溶液于上述5 只容量瓶中，搖勻后靜置7 min，移取0.3 mL10%Al（OH）3于容量瓶中，充分搖勻靜置7 min，移取4.0 mL4%NaOH 溶液于容量瓶中，充分搖勻后，用60%乙醇定容，靜置10 min 后于510 nm 處比色。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=9.811 4X-0.009 6，R2=0.992。按以上方法，調(diào)整適當(dāng)?shù)臉悠窛舛龋M(jìn)行總黃酮含量測(cè)定。總黃酮提取率的計(jì)算：測(cè)定樣品液的吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮提取率，總黃酮提取率計(jì)算公式如下。

式中：c 為總黃酮濃度，mg/mL；V 為樣品溶液體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為板栗葉粉末質(zhì)量，g。1.6 體外抗氧化能力測(cè)試[18]

1.6.1 清除DPPH 自由基的能力

DPPH 自由基清除試驗(yàn)參照楊娜等[19]的方法，測(cè)試板栗葉總黃酮清除DPPH 自由基的能力。將0.5 mL 0.1 mmol/L DPPH 溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）與2 mL 的不同濃度的黃酮提取液進(jìn)行混合，在室溫25 ℃下避光保存30 min，在517 nm 波長下測(cè)定吸光度的減少值，并以BHT 為陽性對(duì)照，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3 組平行。按下式（3）計(jì)算 DPPH 自由基清除率[20]。

式中：Ai為 2 mL 樣品液+0.5 mLDPPH 溶液吸光度；Aj為2 mL 樣品液+0.5 mL95%乙醇溶液吸光度；A0為0.5 mLDPPH 溶液+2 mL95%乙醇溶液吸光度。

1.6.2 清除ABTS+自由基的能力

參照白海娜等[21]的方法，使用ABTS 試劑盒，按比例配制好ABTS 工作液，在30 ℃下避光孵育10 min～30 min，取0.1 mL ABTS 工作液與0.06 mL 不同濃度黃酮提取液進(jìn)行混合（不同濃度的BHT 溶液作參比），靜置6 min，在405 nm 處測(cè)吸光度。以相同濃度的BHT作對(duì)照。按下式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

式中：Ai為 0.06 mL 樣品液+0.1 mL ABTS 工作液吸光度；A0為 0.06 mL 無水乙醇+0.1 mL ABTS 工作液吸光度。

1.6.3 總抗氧化能力

采用亞鐵還原能力試驗(yàn)[22]測(cè)定抗氧化能力。FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別配制濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的FeSO4溶液，參照總抗氧化能力測(cè)試盒說明書按比例配制鐵離子還原能力（ferric reducting ability of plasma，F(xiàn)RAP）工作液。在酶標(biāo)儀微孔板中加入 5 μL 以上濃度的 FeSO4溶液和 180 μL FRAP工作液，37 ℃孵育 5 min，在 593 nm 處測(cè)試吸光度，以FeSO4溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別取 5μL 質(zhì)量濃度為 40、80、120、160、200μmol/L的板栗葉黃酮提取液和180 μL FRAP 工作液于微孔板中，37 ℃孵育5 min，在593 nm 處測(cè)試吸光度。板栗葉黃酮總抗氧化能力以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示。以相同濃度的BHT 作對(duì)照。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均平行3 組，取平均值作為總黃酮的響應(yīng)值，通過方差分析來確定不同因素對(duì)總黃酮提取的顯著性影響。通過使用Design-Expert.8.0.6 軟件對(duì)Box-Behnken 試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到工藝參數(shù)的二次回歸方程。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 循環(huán)次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

循環(huán)次數(shù)對(duì)板栗葉總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 循環(huán)次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of cycle times on extraction rate of total flavonoids

由圖1 可知，在提取溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)30 %，提取時(shí)間 5 min，循環(huán)次數(shù)為 1、2、3 次時(shí)，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，總黃酮提取率先增后減，在循環(huán)次數(shù)為2 次時(shí)達(dá)到最大值，循環(huán)次數(shù)為3 次時(shí)略微下降，繼續(xù)增加循環(huán)次數(shù)不僅浪費(fèi)能源，也不能提高提取率，因此選取循環(huán)次數(shù)1、2、3 次進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.2 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

提取溫度對(duì)板栗葉總黃酮提取率的影響見圖2。

由圖2 可知，在循環(huán)次數(shù)為2 次，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為 30%條件下提取5 min。提取溫度低于70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，總黃酮提取率升高，可能是由于升高溫度使溶液黏度降低，增加了溶質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，從而提高了提取效率。升高溫度，在80 ℃時(shí)總黃酮提取率略有降低，繼續(xù)升高溫度，提取率顯著降低，原因可能是溫度過高導(dǎo)致熱敏型黃酮降解，從而降低了總黃酮提取率。同時(shí)，溫度過高，成本費(fèi)用增加，因此選取60、70、80 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)板栗葉總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖3 可知，在循環(huán)次數(shù)為2 次，提取溫度70 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為30 %的條件下分別提取3、5、7、9、11 min。提取時(shí)間在7 min 之前，總黃酮提取率隨時(shí)間的延長而升高，在7 min 時(shí)達(dá)到最大值，提取時(shí)間大于7 min 時(shí)，提取率下降，因此選取 5 、7、9 min 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)板栗葉總黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，另一影響總黃酮提取率的因素是乙醇的體積分?jǐn)?shù)，保持循環(huán)次數(shù)為2 次，提取溫度70 ℃，提取時(shí)間7 min 不變，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%條件下進(jìn)行提取。乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～70%范圍內(nèi)，總黃酮提取率達(dá)到了最大值，高于此范圍，提取率顯著降低。原因可能是過高的乙醇體積分?jǐn)?shù)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，抑制了黃酮類化合物的溶解，從而影響了提取效果。因此選取30%、50%、70%進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of total flavonoids

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以循環(huán)次數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為因素設(shè)計(jì)因四素三水平的Box-behnken 試驗(yàn)，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，共計(jì)29個(gè)響應(yīng)點(diǎn)進(jìn)行組合試驗(yàn)[23-26]，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Continue table 2 Experimental design and results for response surface analysis

采用Design-Expert 8.0.6 軟件，根據(jù)表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)組合，對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，建立提取工藝參數(shù)回歸模型。回歸方程為：Y=-41.645-3.725A+0.969B+2.851C+0.232D+0.074AB+0.265AC+0.016AD - 0.010BC - 0.001BD - 0.001CD - 1.060A2-0.007B2-0.179C2-0.002D2。

為驗(yàn)證模型的有效性，對(duì)其進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

為了確定二次模型是否顯著，需要對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，P 值用來檢驗(yàn)每個(gè)系數(shù)的顯著性程度和各個(gè)參數(shù)之間的相互作用強(qiáng)度。P 值越小，相應(yīng)系數(shù)的顯著性越強(qiáng)。結(jié)果如表3 所示，回歸模型的F=61.392，P＜0.000 1，表明模型極顯著。回歸方程的決定系數(shù)R2=0.984 0，校正決定系數(shù)R2Adj=0.967 9，表明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合程度良好。方程的變異系數(shù)為4.535%，該值越小，表明重復(fù)性越好。顯著性分析結(jié)果顯示，模型中的B、C、AB、AC、AD、BD、A2、B2、C2、D2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，失擬項(xiàng)P=0.363 8＞0.05，表明建立的二次多項(xiàng)式回歸模型擬合性好，能運(yùn)用于板栗葉總黃酮提取優(yōu)化的理論預(yù)測(cè)。由P 值可知4 個(gè)因素對(duì)板栗葉總黃酮提取率的影響大小順序：C（提取時(shí)間）＞B（提取溫度）＞D（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞A（循環(huán)次數(shù)）。

通過使用Design-Expert.8.0.6 軟件做出的響應(yīng)面圖如圖5 所示。

圖5 四因素交互作用對(duì)板栗葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of interaction between four factors on total flavonoids yield from chestnut leaves

響應(yīng)面圖是響應(yīng)值Y 對(duì)應(yīng)于試驗(yàn)因素A、B、C、D所構(gòu)成的三維空間的曲面圖極其在二維平面上的等高線圖，可以更直觀的表達(dá)出每個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著程度以及各因素間的交互作用[15-16]。通過改變2 個(gè)變量，保持其他變量在零水平來完成的[27]，圖5 為四因素交互作用的響應(yīng)面圖，若三維圖坡面較陡，表明提取條件對(duì)總黃酮提取率影響較為顯著。若坡面較緩，表明提取條件對(duì)黃酮提取率影響較小。圖5A、5B、5C 是循環(huán)次數(shù)和另外3 個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖，循環(huán)次數(shù)坡面均較為平緩，對(duì)總黃酮提取率的影響程度低于另外3 個(gè)因素；3 個(gè)圖的等高線圖均呈橢圓形，說明循環(huán)次數(shù)和另外3 個(gè)因素的交互作用較強(qiáng)，對(duì)總黃酮的提取率影響較大。圖5B、5D、5F是提取時(shí)間和另外3 個(gè)因素對(duì)總黃酮提取率影響的響應(yīng)面圖，可以看出，提取時(shí)間坡面均較陡，說明提取時(shí)間對(duì)于總黃酮提取率的影響較為顯著。圖5E 顯示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，總黃酮提取率隨提取溫度的提高先增加，后趨于平緩；在提取溫度一定時(shí)，總黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加先增后減。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過對(duì)提取條件的單因素分析和響應(yīng)面優(yōu)化，得到了板栗葉總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)：循環(huán)次數(shù)2.03 次，提取溫度 73.35 ℃，提取時(shí)間 7.31 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40.23%。為便于實(shí)際操作將最佳提取條件進(jìn)行修正為循環(huán)次數(shù)2 次，提取溫度73 ℃，提取時(shí)間7.3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40 %，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到板栗葉總黃酮實(shí)際提取率為（5.18±0.06）%，與預(yù)測(cè)值（5.20±0.10）%穩(wěn)合的很好。

2.4 抗氧化結(jié)果

在最佳條件下提取板栗葉黃酮，將得到的黃酮配制成4 μg/mL～20 μg/mL 濃度，研究各濃度梯度黃酮提取液和BHT 對(duì)DPPH 自由基的清除率，結(jié)果如圖6所示。

圖6 板栗葉黃酮對(duì)DPPH 自由基的清除Fig.6 DPPH free radical scavenging activities of flavonoids from chestnut leaves

由圖6 可知，在相同質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，板栗葉黃酮提取液對(duì)DPPH 自由基的清除能力比BHT 更強(qiáng)。在板栗葉黃酮提取液濃度在4 μg/mL～20 μg/mL 范圍內(nèi)，黃酮提取液的DPPH 自由基清除率緩慢上升，表明溶液中的大多數(shù)DPPH 自由基已被清除。

在 40 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，板栗葉黃酮提取液和BHT 對(duì)ABTS+自由基清除率如圖7 所示。

圖7 板栗葉黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除Fig.7 ABTS+free radical scavenging activities of flavonoids from chestnut leaves

由圖7 可知，在板栗葉黃酮提取液濃度為40 μg/mL～120 μg/mL 范圍內(nèi)，其ABTS+自由基清除率略有上升，在板栗葉黃酮提取液濃度為120 μg/mL～160 μg/mL時(shí)，ABTS+自由基清除率上升較快，在板栗葉黃酮提取液濃度為 160 μg/mL～200 μg/mL 時(shí)，其 ABTS+自由基清除率幾乎不變，說明溶液中的大部分ABTS+自由基已經(jīng)被清除。在所測(cè)試濃度范圍內(nèi)，板栗葉黃酮提取液表現(xiàn)出更強(qiáng)的清除ABTS+自由基的能力。

總抗氧化能力分析：在FeSO4溶液濃度為0.1 mmol/L～1.0 mmol/L 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.000 3x-0.011 4，R2=0.991 1。在 40 μg/mL～200 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，板栗葉黃酮提取液和BHT 的總抗氧化能力如圖8 所示。

圖8 板栗葉黃酮的總抗氧化能力Fig.8 Total antioxidant capacity of flavonoids from chestnut leaves

由圖8 可知，板栗葉黃酮提取液濃度在40 μg/mL～160 μg/mL 范圍內(nèi)，其總抗氧化能力上升顯著，在160 μg/mL～200 μg/mL 范圍上升緩慢，在 200 μg/mL 時(shí)達(dá)到最大值，為980.3 μmol/L，在所測(cè)試濃度內(nèi)板栗葉黃酮提取液的總抗氧化能力優(yōu)于BHT。

3 討論

板栗葉中富含黃酮類物質(zhì)，本試驗(yàn)采用的加壓溶劑提取法是以乙醇溶液為提取劑，利用儀器的高壓環(huán)境將黃酮類物質(zhì)提取出來，提高了效率。唐巧玉等[28]采用加壓溶劑提取法對(duì)水芹中總黃酮進(jìn)行提取，在最佳條件下總黃酮得率為3.64%。李雪姣等[29]采用加壓溶劑提取法得到蕤核葉黃酮提取率為8.98%。本試驗(yàn)在最佳提取條件下，板栗葉總黃酮的理論提取率是5.20%。高出唐巧玉等[28]的試驗(yàn)結(jié)果，而低于李雪姣等[29]的試驗(yàn)結(jié)果。使用相同的提取方法對(duì)不同的植物材料進(jìn)行提取，總黃酮提取率存在著較大差異，說明黃酮類化合物廣泛分布在不同的植物體中，同時(shí)也說明板栗葉黃酮含量相對(duì)較高。Aida 等[30]和Beatriz 等[31]研究了歐洲板栗葉的抗氧化活性，本試驗(yàn)板栗葉黃酮提取液清除DPPH 自由基的能力優(yōu)于Aida 等[30]的試驗(yàn)結(jié)果，清除ABTS+自由基的能力優(yōu)于Beatriz 等[31]的試驗(yàn)結(jié)果。分析原因，可能是因?yàn)檠嗌桨謇鹾蜌W洲板栗的生長環(huán)境不同，使得板栗葉中所含黃酮的種類和數(shù)量不同，導(dǎo)致抗氧化結(jié)果存在差異。本試驗(yàn)所提板栗葉總黃酮為粗提液，含有較多雜質(zhì)，所以下一步需對(duì)板栗葉總黃酮提取液進(jìn)一步純化，并分析其化學(xué)成分，深入研究其抗氧化功效。

4 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析得到板栗葉總黃酮加壓溶劑提取的最佳工藝參數(shù)為循環(huán)次數(shù)2 次，提取溫度73 ℃，提取時(shí)間7.3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值穩(wěn)合良好，說明模型能較好的預(yù)測(cè)板栗葉總黃酮提取率。板栗葉黃酮具有抗氧化活性，在一定范圍內(nèi)，總抗氧化能力較強(qiáng)，對(duì)ABTS+自由基和DPPH 自由基均具有較好的清除作用。基于大量板栗葉被當(dāng)做廢物丟棄的現(xiàn)實(shí)情況，以上結(jié)果對(duì)板栗葉資源的回收利用具有實(shí)際意義。