梁王茶葉及其速溶茶粉的化學成分分析和抗氧化研究

趙春燕，龔加順，楊磊幫，王秋萍

（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南昆明650201）

梁王茶屬（Nothopanax Miq.）系五加科（Araliaceae）的常綠、無刺灌木或喬木，全世界約有15 種，主要分布于大洋洲，我國僅有2 種，即掌葉梁王茶[Nothopanax delavayi（Franch.）Harms ex Diels，LWC]和異葉梁王茶[N.davidii（Franch.）Harms ex Diels][1]。梁王茶又稱梁旺茶，山檳榔、良旺茶、樹五加、白雞骨頭樹等[2]。我國梁王茶野生資源主要集中在華中、西南、西北地區(qū)，多生長在海拔350 m～3 000 m，野外生存環(huán)境多數(shù)為山坡、溝谷和竹、林木下或灌木叢中及河邊或路旁[1]。梁王茶是云南白族的藥用植物，白語稱作“構(gòu)肌肝”（云龍、劍川）、“構(gòu)肝丘”（洱源）、“武伙”（云龍，意譯：回味、清涼）。藥用全株，味甘、微苦、性涼，具清熱解毒、活血舒筋、止渴、止咳、理氣消食、止痛等功效。白族民間用于治咽喉痛、咳嗽、消化不良、蛔蟲、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、腸炎、解煙毒，根用于風濕骨痛[2]。現(xiàn)代藥理研究表明，掌葉梁王茶的根與莖具有較好的鎮(zhèn)痛作用[3]。梁王茶的五環(huán)三萜物質(zhì)具有抗癌抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用、消炎鎮(zhèn)痛作用、抗病毒抑菌作用以及預防心腦血管疾病等作用[4]。

目前對梁王茶的研究主要集中在異葉梁王茶的根、樹皮等部位的化學成分分析，對于掌葉梁王茶的研究極少。在我國掌葉梁王茶主要分布在云南、貴州、四川、湖南及湖北，尤其是云南海拔1 700 m～3 000 m山谷闊林、混交林或灌叢中[5]。云南省蘭坪縣是掌葉梁王茶生長的最適宜地區(qū)，當?shù)赜袑⑵淠廴~入食的習俗。采摘梁王茶嫩葉，水洗瀝干后，按照綠茶加工工藝，殺青、揉捻、曬干后制成梁王茶茶葉，沖泡后，其茶香撲鼻，湯色金黃清澈，茶湯過喉，圓潤甘甜。

相關(guān)報道已對梁王茶不同部位的化學成分進行了鑒定。庾石山等從異葉梁王茶樹皮中分離得到2 種五環(huán)三萜皂甙（異葉梁王茶甙III 和IV）、2 種新的三萜皂苷（異葉梁王茶苷Ⅶ和Ⅷ）、梁王茶苷Ⅱ、及5 種新化合物（異葉梁王茶甙Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ和Ⅺ）[6-10]。洪化鵬等從異葉梁王茶干葉中分離得到2 種齊墩果烷型三萜及2 種三萜類化合物（3β-olean-12-ene-28，29-dioic acid和梁王素A）[11-12]。楊青等從掌葉梁王茶莖皮的70%乙醇提取物中分離得到11 個化合物，主要為糖苷、糖酯苷[13]。梁王茶新鮮植株有芳香氣味，胡英杰等對掌葉梁王茶精油的化學成分進行了研究，其研究結(jié)果鑒定出梁王茶中有月桂烯、萜烯-4-醇、異松油烯、2-環(huán)氧丙烷、1-己醇等42 種化學成分[14]。洪化鵬等對異葉梁王茶鮮葉的精油組分進行分析，測得主要成份有月桂烯等11 種，經(jīng)評香屬花香型精油[15]。繆明志從異葉梁王茶和掌葉梁王茶的不同藥用部位提取、分離、純化梁王茶多糖，發(fā)現(xiàn)掌葉梁王茶的根中可溶性多糖含量最高，平均為 1.68%[16]。

關(guān)于掌葉梁王茶葉的化學成分及其抗氧化尚無報道，亦無梁王茶葉速溶茶粉的相關(guān)報道。因此本研究以掌葉梁王茶葉為原料，采用熱水浸提法制備梁王茶葉速溶粉，比色法研究梁王茶葉及其速溶茶粉的化學組分及其抗氧化能力，并對梁王茶葉17 種游離氨基酸進行了測定，旨在為梁王茶的深度開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

掌葉梁王茶茶葉：由蘭坪潤民農(nóng)產(chǎn)品有限責任公司提供。

牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）：生物試劑，上海源葉生物科技有限公司；茚三酮：生物純，上海斯信生物科技有限公司；考馬斯亮藍（G-250）：高級純，上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、苯酚：分析純，天津風船化學試劑科技有限公司；濃硫酸：分析純，重慶川東化工有限公司；乙腈：分析純，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心。

Jan-80 離心機：常州市華普達教學儀器有限公司；ELX 808 酶標儀：美國伯騰公司；BILON-12 真空冷凍干燥機：鄭州比朗儀器有限公司；HH-8 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；AR224CN 電子天平：奧豪斯儀器有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 梁王茶速溶茶粉的提取工藝

1.2.1.1 梁王茶速溶茶粉提取工藝流程

干茶→粉碎→過200 目→熱水浸提→過濾（紗布粗濾，再經(jīng)濾紙抽濾）→減壓濃縮（65 ℃）→真空冷凍干燥→速溶茶粉

1.2.1.2 正交試驗

以浸提溫度、浸提時間、料液比、提取次數(shù)這4 個因素為研究對象，按四因素三水平即L9（43）正交表進行試驗，見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor and level table of orthogonal design

每組試驗均稱取20 g 茶葉進行浸提，茶粉提取率的計算為：提取率/%=茶粉質(zhì)量/原料茶葉質(zhì)量×100

1.2.2 梁王茶葉及其速溶茶粉的化學成分測定

水溶性蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法[17]，標準曲線為：y=3.295x+0.003，R2=0.998（其中 x 為牛血清白蛋白濃度（mg/mL），y 為 595 nm 處吸光值）。水溶性氨基酸含量測定采用茚三酮比色法[18]，標準曲線為：y=0.796x-0.005，R2=0.993（其中 x 為谷氨酸濃度（mg/mL），y 為570 nm 處吸光值）。水溶性總糖、多糖含量的測定采用苯酚硫酸法[19-20]，標準曲線為：y=3.041x+0.039，R2=0.995 其中 x 為葡萄糖濃度（mg/mL），y 為 490 nm 處吸光值）。測定多糖含量時，茶葉和茶粉的制樣方法分別為：茶葉與水的比例為1 g ∶30 mL，沸水浴浸提30 min，濾紙過濾，濾液定容至30 mL。取濾液1 mL，加4 mL 無水乙醇醇沉6 h，3 000 r/min 離心5 min，沉淀加10 mL水溶解即得多糖待測液；0.025 g 茶粉溶于10 mL 水中，從中取出1 mL 加4 mL 無水乙醇醇沉6 h，3 000 r/min離心5 min，沉淀加10 mL 水溶解即得多糖待測液。總多酚、總黃酮含量的測定采用福林酚比色法[21]，標準曲線為：y=5.416 1x+0.012，R2=0.997（其中 x 為沒食子酸濃度（mg/mL），y 為 765 nm 處吸光值）。測定總黃酮時，樣品的制樣方法為[22]：于2 mL EP 管中，加入1 mL 測總多酚的樣品、0.5 mL HCl（濃鹽酸∶水=1 ∶4，體積比）、0.5 mL 35%甲醛，暗處放置24 h 后在3 000 r/min 下離心5 min，沉淀為黃酮，用福林酚法分析上清液中非黃酮含量。總黃酮含量=總多酚含量-非黃酮含量。游離氨基酸的測定：參照國標GB 5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》，采用氨基酸分析儀（茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀）進行測定[23]。

1.2.3 抗氧化活性的測定

在黑城文書中，有一件標號為Y1: W 99的文書提到了儒學教授楊景仁，他是至正三年(1343)八月接受敕牒，至正四年二月到亦集乃路上任的。[注]前引李逸友編著《黑城出土文書(漢文文書卷)》，第123頁。與這件文書中提到的“敕受亦集乃路儒學教授楊景仁”為同一人。該文書寫于至正六年(1346)二月，當時楊景仁已經(jīng)在亦集乃路執(zhí)教整整兩年了。

根據(jù)Wang 等[24]的方法測定梁王茶葉及其速溶茶粉對DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除能力。其清除率的計算方法如下：DPPH 自由基清除率/ %=（ADPPH-A樣品對照-A樣品）/ADPPH×100，其中 ADPPH為：780 μL 0.094 mmoL/L DPPH+20 μL 超純水；A樣品對照為：780 μL甲醇+20 μL 樣品；A樣品為 780 μL 0.094 mmoL/L DPPH+20 μL 樣品，將上述溶液混勻，置于暗處放置30 min 后測得的吸光值。ABTS 自由基清除率/%=（AABTS-A樣品）/AABTS×100，式中 AABTS為 1 mL ABTS 自由基工作液與10 μL 超純水混勻反應后，所測吸光值；A樣品為1 mL ABTS 自由基工作液與10 μL 樣品混勻反應后，所測吸光值。

根據(jù)Heleno 等[25]的方法測定梁王茶葉及速溶茶粉的還原力，吸光值越大則還原力則越強。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，所有數(shù)據(jù)先進行Grubbs 檢驗，以排除過失誤差；經(jīng)G 檢驗合格的數(shù)據(jù)，采用SPSS 19.0，用鄧肯氏法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梁王茶速溶茶粉提取的最佳條件

梁王茶速溶茶粉提取的正交試驗結(jié)果見表2。

通過比較表2 中的極差R 可知，各因素關(guān)系為D>B>A>C，即對梁王茶速溶茶粉提取率的影響依次為提取次數(shù)>浸提時間>浸提溫度>料液比；最佳因素水平組合為A3B3C3D3，即最佳的浸提條件為溫度85 ℃，浸提 60 min，料液比 1 g ∶30 mL，浸提次數(shù) 3 次。按較優(yōu)條件A3B3C3D3，進行3 重復的驗證試驗，得到梁王茶速溶茶粉的提取率為39.88%。

表2 梁王茶速溶茶粉提取的正交試驗結(jié)果Table 2 Extraction of instant tea power from LWC leaves by orthogonal test

2.2 梁王茶葉及其速溶茶粉的化學成分分析

梁王茶葉及其速溶茶粉的化學成分分析見表3。

由表3 可知，除水分含量外，梁王茶速溶茶粉的各種成分含量均高于茶葉，這是因為梁王茶速溶茶粉是由梁王茶葉的水提物，經(jīng)濃縮干燥后所得。梁王茶葉的主要化學組分含量依次為：水溶性總糖47.32 g/kg＞總多酚13.76 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)9.58 g/kg＞水溶性氨基酸5.91 g/kg＞水溶性多糖1.89 g/kg＞總黃酮0.88 g/kg。梁王茶速溶茶粉的主要化學組分含量依次為：水溶性總糖236.05 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)99.47g/kg＞水溶性氨基酸30.83 g/kg＞總多酚27.08 g/kg＞水溶性多糖17.99 g/kg＞總黃酮2.03 g/kg。由此可知，除總多酚外，梁王茶速溶茶粉中主要化學組分的含量高低與其原料梁王茶葉中相似。總多酚含量在梁王茶葉中高于水溶性蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，而在梁王茶速溶茶粉中低于水溶性蛋白質(zhì)和氨基酸的含量，這是因為梁王茶速溶茶粉是由梁王茶葉水提物濃縮干燥而得，而梁王茶葉中的多酚可能主要為醇溶性多酚。梁王茶葉和速溶茶粉中的水溶性總糖含量均高于其他組分，其中茶葉中水溶性總糖的平均含量為47.32 g/kg，這與繆明志[16]報道的梁王茶中可溶性總糖的平均含量為60.5g/kg 相近。

表3 梁王茶葉及其速溶茶粉的化學成分分析Table 3 Chemical compositions of LWC leaves and its instant tea powder

總糖、多糖能夠提供熱能，維持血糖，參與構(gòu)造組織細胞[26]；蛋白質(zhì)可以增強機體抵抗力[27]；氨基酸是構(gòu)成茶湯鮮爽滋味的主體成分[24]；多酚是茶湯滋味濃度和湯色的決定因素，但它又是澀味形成的主要物質(zhì)，它的含量如果過高，則會明顯的苦澀味，因此，對品質(zhì)要求來說，多酚含量必須在一個適當?shù)暮糠秶畠?nèi)[28]；黃酮是一類具有抗菌、抗炎作用的物質(zhì)[29]。從梁王茶速溶茶粉的主要化學組分可看出，其營養(yǎng)豐富，并含有一定量的多酚、黃酮及多糖等生物活性成分，是一款較為健康的速溶茶飲品。

2.3 梁王茶葉17種游離氨基酸的含量

圖1 梁王茶葉17 種游離氨基酸含量Fig.1 Contents of 17 free amino acids in LWC leaves

由圖1 可知，在梁王茶葉中共測得17 種游離氨基酸，其含量依次為組氨酸45.74 mg/kg＞天門冬氨酸29.85 mg/kg＞谷氨酸 14.34 mg/kg＞絲氨酸 11.89 mg/kg＞蘇氨酸8.9 mg/kg＞賴氨酸7.90 mg/kg＞胱氨酸6.46 mg/kg＞精氨酸4.72mg/kg＞蛋氨酸4.59mg/kg＞脯氨酸4.30 mg/kg＞丙氨酸2.66mg/kg＞纈氨酸1.89 mg/kg＞甘氨酸1.64 mg/kg＞亮氨酸1.30 mg/kg＞絡氨酸1.13 mg/kg＞苯丙氨酸0.99 mg/kg＞異亮氨酸0.86 mg/kg。組氨酸被認為是一種人類（主要是兒童）必需的氨基酸，組氨酸也是尿毒癥患者的必需氨酸[30]。

2.4 梁王茶葉及其速溶茶粉的抗氧化活性

梁王茶葉及其速溶茶粉的抗氧化活性如圖2 所示。

圖2 梁王茶葉及其速溶茶粉的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of LWC leaves and its instant tea powder

如圖2A～圖2C 所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著梁王茶葉濃度增加，其對DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率，及其還原力均增加，與濃度呈正相關(guān)。梁王茶葉清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50分別為3.92、12.84 mg/mL，表明梁王茶葉對DPPH 自由基的清除優(yōu)于ABTS 自由基。吸光值越大還原力越強，梁王茶葉的還原力在2 mg/mL～15 mg/mL 范圍內(nèi)隨濃度增加顯著（P＜0.05）；而在 15 mg/mL～50 mg/mL 范圍內(nèi)，還原力增加平緩（P＞0.05）；在15 mg/mL 時，還原力達到2.966。

如圖2D～圖2F 所示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著梁王茶速溶茶粉濃度增加，其對DPPH 自由基和ABTS自由基的清除率，及其還原力均增加，與濃度呈正相關(guān)。梁王茶速溶茶粉清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的IC50分別為1.60、1.36 mg/mL，表明梁王茶速溶茶粉對ABTS 自由基的清除優(yōu)于DPPH 自由基。梁王茶速溶茶粉在0.1 mg/mL～2 mg/mL 范圍內(nèi)還原力顯著增加（P＜0.05），在 2 mg/mL～3.5 mg/mL 范圍內(nèi)還原力增加不顯著（P＞0.05），在 3.5 mg/mL 時，還原力為 3.343。梁王茶速溶茶粉是由梁王茶葉水提物濃縮干燥而得，其主要化學組分含量均高于梁王茶葉。其中梁王茶速溶茶粉的生物活性成分水溶性多糖（17.99 g/kg）、多酚（27.08 g/kg）、黃酮（2.03 g/kg）分別為梁王茶葉的 9.52、1.97、2.31 倍，因此其還原力，及對DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率均優(yōu)于梁王茶葉。

3 結(jié)論

掌葉梁王茶葉的主要化學組分依次為水溶性總糖47.32 g/kg＞總多酚13.76 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)9.58 g/kg＞水溶性氨基酸5.91 g/kg＞水溶性多糖1.89 g/kg＞總黃酮0.88g/kg，含量最多的游離氨基酸是組氨酸45.74 mg/kg。以掌葉梁王茶葉為原料，采用熱水浸提法制備梁王茶速溶茶粉，其最佳浸提條件為料液比1 g ∶30 mL，溫度85 ℃，浸提60 min，浸提次數(shù)3 次，此條件下速溶茶粉的提取率達到39.88%。所得梁王茶速溶茶粉的主要化學組依次水溶性總糖236.05 g/kg＞水溶性蛋白質(zhì)99.47 g/kg＞水溶性氨基酸30.83 g/kg＞總多酚27.08 g/kg＞水溶性多糖17.99 g/kg＞總黃酮2.03 g/kg。梁王茶葉及其速溶茶粉清除DPPH 自由基的IC50分別為3.92、1.60 mg/mL；清除ABTS 自由基的IC50分別為12.84、1.36 mg/mL。梁王茶速溶茶粉的還原力，及對DPPH 自由基和ABTS 自由基的清除率均優(yōu)于梁王茶葉。梁王茶速溶茶粉營養(yǎng)豐富，并含有一定量的多酚、黃酮及多糖等生物活性成分，有較強的抗氧化能力，是一款較為健康的速溶茶飲品。