蒲公英酚酸綜合提取技術優化及質量評價

吳哲 李趙嘉 馮薇 孟然 王秀萍

摘要：為獲得快速和準確檢測蒲公英成分的提取工藝，以甲醇為提取劑，通過超聲波和酶解輔助提取，采用響應面設計方法，結合指紋圖譜綜合質量評價方法，篩選最佳提取工藝。結果表明，纖維素酶有利于提升提取和檢測結果的穩定性，液料比對提高提取率具有促進作用，甲醇與提取時間或甲醇與液料比對提取率的提升表現出了協同作用。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜分析結果顯示，在所有的處理中，綠原酸和咖啡酸與對照圖譜匹配度均為100%，以二者含量為綜合評價指標，獲得的最佳提取條件為纖維素酶0.1%，pH值為4，液料比為300 ∶ 1（mL ∶ g），甲醇體積分數為40%，超聲提取時間120 min。本提取技術降低了操作成本，檢測結果穩定，可直接用于實驗室蒲公英酚酸類成分檢測;同時，本研究中的提取優化方法也為其他植物成分提取技術優化提供了參考。

關鍵詞：蒲公英;指紋圖譜;咖啡酸;綠原酸;優化及質量評價

中圖分類號：R284.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）23-0190-06

蒲公英是一種常見的中草藥，富含多糖、綠原酸、咖啡酸、總黃酮等多種活性成分。近年來隨著人們健康意識的提高，蒲公英逐漸成為一種藥食兼用植物?，F代藥理研究表明，蒲公英具有廣譜抑菌、抗氧化、抗腫瘤和免疫促進等作用，而這些作用與酚酸類物質有一定的關系[1-2]。因此蒲公英不僅在醫藥衛生領域備受關注，在食品特別是功能性食品的研究開發上也成為熱點。而酚酸類化合物的提取以及檢測則成為蒲公英應用開發的重要基礎。

咖啡酸和綠原酸均為蒲公英的主要活性物質[3]，且《中華人民共和國藥典》2015年版規定蒲公英咖啡酸含量不應低于0.02%。蒲公英成分含量變化除了與種類和栽培條件有關之外[4]，也與提取技術有關[1]。蒲公英成分提取方法按提取劑可分為水提和醇提，原理是酚酸物質易溶于水和醇類溶劑。因此可將原料溶于提取劑，同時輔以物理方法或酶解方法破碎細胞壁，可提高酚酸成分提取率。提取工藝通常有熱水浸提、超聲波輔助提取、回流浸提等方法。影響提取率的因素還包括料液比、提取時間、提取溫度、溶劑濃度等，不同的提取條件有可能導致蒲公英成分結構變化[1，3，5]，進而影響成分功效。因此如何平衡最大的提取率及提取質量成為本研究的重點內容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹東蒲公英（Taraxacum antungense）葉片干粉為河北省農林科學院濱海農業研究所選育的濱蒲1號葉片加工獲得。60 ℃烘干至恒質量，粉碎后過80目篩，粉末置干燥器中干燥保存、備用。

咖啡酸、綠原酸、阿魏酸及木樨草素標準品購自中國藥品生物制品檢定所;無水甲醇為國產分析純;纖維素酶酶活性為10 000 U/g;純化水由河北省農林科學院濱海農業研究所制備。

1.2 提取工藝及優化

稱取一定量蒲公英樣品，放入50 mL具塞離心管中，加入5 mL纖維素酶溶液（質量濃度為0.1%，pH值為4），置于60 ℃水浴加熱30 min[1，6];隨后離心管中加入甲醇溶液20 mL，進行超聲提取，超聲波功率120 W，提取結束后離心取上清液，待測。優化的參數為甲醇濃度、料液比以及提取時間，具體提取參數及蒲公英樣品質量按響應面優化設計表進行（表1）。

1.3 檢測方法

利用注射器輔以0.45 μm濾膜將提取液注入進樣瓶，準備液相檢測。液相檢測條件為安捷倫 1 200 HPLC，鉆石1代C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）;流動相：A（0.02% 磷酸水溶液） ∶ B（甲醇）=50 ∶ 50;檢測波長：350 nm;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：10 μL。

配制不同濃度的綠原酸和咖啡酸標品，與對應的HPLC峰面積建立標準曲線，經擬合后，標準曲線分別為y1=16.835x1-16.971、y2 =22.173x2-13.042。其中，y1、y2為綠原酸和咖啡酸峰面積;x1和x2為綠原酸和咖啡酸含量，μg/mL。有效檢測范圍為0～100 μg/mL。

1.4 數據分析

為了更好地評價提取工藝，將不同提取條件下的綠原酸和咖啡酸得率加權，以總咖啡酸得率為優化目標[11]，利用Design Expert 8.0.6軟件綜合評價提取工藝。加權方法：以綠原酸和咖啡酸得率的算術平均值比值為系數（k），將綠原酸轉換為咖啡酸，可得總咖啡酸得率，經計算k=0.544（表1），即：總咖啡酸得率=綠原酸得率（%）×0.544+咖啡酸得率（%）。最后將HPLC數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，進行相似度分析。試驗每個處理重復4次，結果以平均數±標準誤形式呈現，采用SPSS 16.0軟件Duncans新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 咖啡酸提取工藝優化

試驗結果表明，Cubic模型擬合結果呈顯著性（F=6.855，P=0.039），但是部分交叉項超出可信范圍，調整后模型變為y=5.710-0.410x1+0.740x2-0.190x3+0.078x1x2-0.480x1x3+0.048x2x3-0.140x21-0.800x22+0.260x23-0.660x21x2+1.170x21x3+1.880x1x22，R2=0.95，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇含量，液料比和時間。根據模型的方差分析（表2），從單因子影響結果看，液料比顯著促進提取率（F=9.416，P=0.037），其他2個因素對提取率沒有顯著影響，影響力大小為液料比>甲醇含量>時間。從影響因子協同效果看，甲醇含量與時間（A2C，F=11.536，P=0.027），甲醇含量與液料比（AB2，F=29.85，P=0.006）協同作用均對提取率有顯著促進作用。根據實際數值，擬合函數為 y= 0.884 28x1+ 0.221 73x2+ 0.361 80x3-0.001 71x1x2-0.013 38x1x3+0.000 01x2x3-0.003 35x21-0.000 77x22+0.000 13x23-0.000 03x21x2+0.000 12x21x3+ 0.000 01x1x22-36.276 06。據此，可獲得10個最高提取率的方案（表3），其中優化后的甲醇濃度主要圍繞在40%和70%，提取時間主要圍繞在120 min，液料比主要圍繞在200 ∶ 1（mL ∶ g）和300 ∶ 1（mL ∶ g）。由表3可知，最高提取率的方案為甲醇濃度40%，液料比200.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間 120 min，預期咖啡酸含量7.7 mg/g。

2.2 綠原酸提取工藝優化

利用同樣的分析及處理方法，對綠原酸提取工藝進行優化，可得到擬合模型，即y=3.059-0.107x1+0.255x2+0.005x3+0.055x1x2-0.075x1x3+0.004x2x3-0.055x21-0.196x22-0.019x23-0.122x21x2+0.228x21x3+0.356x1x22，R2=0.98，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇濃度，液料比和時間。根據模型結果和方差分析（表4）可知，甲醇濃度（F=9.660，P=0.036 0）和液料比（F=54.960，P=0.002 0）均對綠原酸提取率有顯著促進作用，甲醇濃度與時間（A2C，F=22.010，P=0.009 0），甲醇濃度與液料比（x1x22，F=53.550，P=0.002 0）協同作用均對提取率有顯著促進作用。根據優化模型，可獲得10個最高提取率的方案（表5），其中優化后的甲醇濃度主要為40%、70%，提取時間約為 120 min，而液料比約為200 ∶ 1（mL ∶ g）和300 ∶ 1（mL ∶ g），最高提取率的方案為甲醇濃度40%，液料比 203.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120.0 min，預期綠原酸含量為3.40 mg/g。

2.3 總酚酸提取工藝優化

對咖啡酸和綠原酸加權處理后?利用同樣的分析方法，對總酚酸提取工藝進行優化，可得到擬合模型，即y=7.374 0-0.472 5x1+0.885 0x2-0.190 0x3+0.107 5x1x2-0.522 5x1x3+0.050 0x2x3-0.167 0x21-0.909 5x22+0.250 5x23-0.732 5x21x2+1.287 5x21x3+2.065 0x1x22，R2=0.96，其中y為咖啡酸含量，x1、x2、x3為甲醇濃度，液料比和時間。根據模型結果和方差分析可知，液料比（F=11.610，P=0.027 1）對總酚酸提取率有顯著性促進作用，甲醇濃度與時間（A2C，F=12.290，P =0.025 0），甲醇濃度與液料比（AC，F=31.620，P =0.005 0）協同作用均對提取率有顯著促進作用（表6）。根據模型可得到10個最高提取率的方案，其中優化后的甲醇濃度約為40%、70%，提取時間約為120.0 min，液料比約為200.0 ∶ 1、300.0 ∶ 1（mL ∶ g）。由表7可知，最高提取率方案為甲醇濃度40%，液料比202.7 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間 120.0 min，預期總酚酸含量為9.55 mg/g。

2.4 總成分提取工藝指紋圖譜分析與聚類分析

將所有提取液的HPLC數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統中，經數據匹配，以中位數法建立對照指紋圖譜（圖1、表8）。結果顯示所有峰的保留時間RSD均小于1%，說明所有的提取工藝一致性較好。蒲公英樣品共檢測出10種成分，其中所有提取方法均檢測出綠原酸（4號）和咖啡酸（8號），二者為共有成分，與對照圖譜匹配度為100%。其他成分1號、5號、9號匹配度也較高，經標準品檢測和文獻查閱，這3種成分為七葉內酯[3，7]、木樨草素-7-O-β-D葡萄糖苷[3，7]和阿魏酸。通過指紋圖譜相似度分析，所有的提取工藝之間相似度均在0.98以上，說明所有的提取工藝在質量上具有高度相似性。為了更好地篩選提取工藝，筆者以咖啡酸和綠原酸峰面積為聚類指標，應用SPSS分析軟件，采用組間聯結、歐氏聚類法，所有提取工藝的聚類分析結果見圖2。

當閾值為10時，所有的提取工藝被劃分為兩大類，其中10號處理被單列為一類，其他16種處理被劃為一大類。隨著閾值的減小，所有提取工藝可分為5類，其中處理5為單獨一類。結合響應面優化模型給出的方案可知，處理5提取率最高，其次為處理2、處理3、處理4、處理6、處理8、處理9、處理12、處理17。

2.5 提取工藝篩選與驗證

根據響應面優化模型，本研究獲得3個最高提取率的條件，這3個條件非常相近，因此可確定優選條件（Ⅰ）為甲醇濃度40%，液料比200 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間 120 min。同時結合聚類分析結果，筆者選擇提取率相對中等（Ⅱ）和低水平（Ⅲ）的2個條件，分別為甲醇濃度70%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120 min;甲醇濃度60%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間30 min;提取結果見圖3。結果顯示試驗結果與軟件模擬計算結果差異不顯著，說明優化模型預測結果可信。另外，優選條件Ⅰ的咖啡酸提取率顯著高于條件Ⅲ，但與條件Ⅱ差異不顯著（P=0.785），說明優選條件Ⅰ和Ⅱ均可作為最佳提取工藝。

2.6 纖維素酶及離心操作對提取及檢測結果的影響

本試驗優化工藝篩選是基于加酶輔以超聲波提取，由于水浴過程中可能存在酶解不完全或水分損失問題，因此筆者考察纖維素酶以及離心操作后二次定容對檢測結果的影響。由于咖啡酸是《中華人民共和國藥典》2015版規定的參考標準，因此筆者在優選條件Ⅱ下比較了不同操作咖啡酸檢測結果（表9）。結果發現無論是否離心，加酶偏差最小，說明加酶后可提高該工藝的穩定性。離心定容后咖啡酸含量均降低，說明二次定容帶來的絕對誤差加大，因此本研究中的提取及檢測不需要二次定容，須注意水浴過程中盡可能避免水分損失。

3 結論與討論

目前商業生產中蒲公英成分提取多采用水提法，是因為考慮到提取劑成本以及提取設備復雜程度相對較低[1]，而小規模提取多采用乙醇溶劑提取[5-6，8]，是因為酚酸物質更易溶于醇類溶劑。本研究采用甲醇為溶劑，是因為酚酸物質檢測多用HPLC檢測方法，如GB/T 22250—2008《保健食品中綠原酸的測定》以及《中華人民共和國藥典》2015年版等。甲醇由于極性好，常用于HPLC流動相。因此本研究直接用甲醇提取，省略了乙醇提取物旋蒸發+甲醇二次溶解步驟[4，8-10]，不僅降低了液相進樣的前處理時間，提高了檢測效率，也減少了試驗操作誤差，提高了檢測準確率。

已發表文獻中蒲公英樣品質量多在1 g左右，液料比常見于（10～30） ∶ 1（mL ∶ g）之間[1，2，9-10]。本研究發現，液料比過低容易使溶解不充分，影響提取效果。本研究中干樣品質量約為0.1 g，甲醇 25 mL，降低材料成本。另外從指紋圖譜可知，蒲公英主要物質在15 min內即可檢出，因此在用液相色譜檢測蒲公英咖啡酸和綠原酸時，可將檢測時間控制在 15 min 內，從而降低了檢測時間成本。根據優化結果，在酶解+超聲波輔助提取條件下，如果從節約成本的角度，本研究推薦優化條件 Ⅰ，即甲醇40%、液料比200 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120 min;如果考慮提取率和綜合質量，則選擇優化條件 Ⅱ，即甲醇70%，液料比300 ∶ 1（mL ∶ g），提取時間120 min。

目前關于蒲公英有效成分提取技術優化研究主要集中在提高某一種成分提取率或浸出物總提取率方面;在用于提取質量評價的指標篩選過程中，筆者利用指紋圖譜分析，采用多指標評價了提取質量，這對評價成分復雜的中藥材，具有一定的科學合理性[11]。本研究為綜合評價中藥材質量提供了一種思路，即可根據各成分在藥效中所起的作用賦予不同的權重系數綜合評分進行評價，避免了對多指標單獨評價時相互間的沖突。同時本研究的提取優化方法也為其他植物成分提取技術優化提供了參考。

參考文獻：

[1]王秋亞. 蒲公英有效成分的提取及應用研究進展[J]. 江蘇農業科學，2016，44（8）：21-24.

[2]何婷婷，柴軍紅，鐘讀波，等. 蒲公英活性成分提取工藝的優化、多糖紅外表征及其抗氧化性[J]. 江蘇農業科學，2018，46（11）：163-166.

[3]王亞茹，李雅萌，楊 娜，等. 蒲公英屬植物的化學成分和藥理作用研究進展[J]. 特產研究，2017（4）：71-79.

[4]寧 偉，賈慶飛，朱 丹，等. 東北地區11種蒲公英咖啡酸和綠原酸的含量測定[J]. 沈陽農業大學學報，2012，43（5）：595-598.

[5]李喜鳳，郝 哲，邱天寶，等. 蒲公英中有機酸類成分的提取工藝研究[J]. 中成藥，2011，33（2）：262-265.

[6]張桂芳，郭希娟，王瑞琦. 響應面法優化超聲波輔助萃取蒲公英多酚的研究[J]. 中國醫院藥學雜志，2017，37（5）：421-426.

[7]姚 巍，林文艷，周長新，等. 蒙古蒲公英化學成分研究[J]. 中國中藥雜志，2007，32（10）：926-929.

[8]王 鵬，郭 麗. 響應面法優選蒲公英中綠原酸的提取工藝研究[J]. 北方園藝，2010（23）：44-46.

[9]張 玲，李繼昌，許 薇，等. 響應曲面法優化蒲公英中咖啡酸的提取工藝[J]. 飼料研究，2013（5）：83-86.

[10]尹 青，張 華. 超聲波法提取蒲公英中的綠原酸[J]. 食品研究與開發，2009，30（5）：23-27.

[11]李景華，鐘佳佳，劉玉芹，等. 吉林12種蒲公英HPLC指紋圖譜研究[J]. 植物研究，2014，34（3）：423-427.江 偉，張 曉，李 曼，等. 江蘇省倉儲小麥品質性狀分析[J]. 江蘇農業科學，2020，48（23）：196-199.