巴西橡膠樹(shù)MADS-box基因家族6個(gè)成員的染色體物理定位

陶志強(qiáng) 張宇航 王英 高和瓊 莊南生

摘? 要：MADS-box基因家族廣泛分布于真核生物中，巴西橡膠樹(shù)的MADS-box基因家族主要參與花形態(tài)建成，對(duì)生殖生長(zhǎng)起到重要的調(diào)節(jié)作用。目前，MADS-box基因家族的26個(gè)相關(guān)基因已被克隆分析，但它們?cè)谌旧w上的具體位置還未確定。本研究以巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97品種為材料，將MADS-box基因家族的6個(gè)成員（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1）定位在細(xì)胞核染色體上，通過(guò)雙探針熒光原位雜交技術(shù)（FISH）對(duì)巴西橡膠樹(shù)MADS-box基因家族的這6個(gè)成員在細(xì)胞核染色體上進(jìn)行物理定位分析。結(jié)果表明：MADS-box基因家族的6個(gè)基因分別位于不同的染色體上，其中HbAGL15、HbAG8、HbAG30和HbSVP1基因定位在第4、5、7和8號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，其信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的平均百分距離是11.85、39.71、48.94和6.70;HbTT16和HbAP1基因定位在第1和13號(hào)染色體短臂上，其信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的平均百分距離是22.19和18.01。本研究結(jié)果揭示了巴西橡膠樹(shù)MADS-box基因家族的6個(gè)成員在細(xì)胞核染色體上的實(shí)際位置，展現(xiàn)家族基因之間的分布特點(diǎn)和連鎖遺傳關(guān)系，不僅豐富了橡膠樹(shù)分子細(xì)胞遺傳學(xué)信息，也為橡膠樹(shù)的分子輔助育種和比較基因組學(xué)研究提供了分子細(xì)胞遺傳學(xué)的科學(xué)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹(shù);MADS-box基因家族;熒光原位雜交（FISH）;物理定位

中圖分類(lèi)號(hào)：Q23? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The MADS-box gene family is widely distributed in eukaryotes. The MADS-box gene family of Hevea brasiliensis is mainly involved in flower morphogenesis and plays an important role in regulating reproductive growth. At present， 26 related genes of the MADS-box gene family have been cloned and analyzed， but the specific positions on the chromosome have not been determined. Six members of the MADS-box gene family （HbAGL8， HbAG15， HbAGL30， HbTT16， HbAP1 and HbSVP1） of ‘Reyan 7-33-97 were localized on the nuclear chromosome. Physical localization analysis of the six genes on the nuclear chromosome was performed using dual-probe fluorescence in situ hybridization （FISH）. The results showed that the six genes were located on different chromosomes. HbAGL15， HbAG8， HbAG30 and HbSVP1 genes were located on the long arm of chromosome 4， 5， 7 and 8 with PDCS （percent distance from centromere to the signal site） 11.85， 39.71， 48.94 and 6.70， respectively. HbTT16 and HbAP1 gene were located on the short arm of chromosome 1 and 13 with PDCS 22.19 and 18.01， respectively. This study reveals the actual position of the six genes of H. brasiliensis on the nuclear chromosome， shows the distribution characteristics and linkage genetic relationship between family genes， which not only enriching molecular cytogenetics information， but also providing scientific theoretical basis for molecular assisted breeding and comparative genomics research of H. brasiliensis.

Keywords： Hevea brasiliensis; MADS-box gene family; fluorescence in situ hybridization （FISH）; physical localization

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.001

MADS-box基因家族是一類(lèi)序列相對(duì)保守的基因家族，它編碼的蛋白具有激活或抑制目的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用，廣泛分布于真核生物中，最先在Minichromosome Maintenance（酵母菌代謝調(diào)節(jié)因子）[1]、Agamous（擬南芥花器官發(fā)育決定因子）[2]、Deficienns（金魚(yú)草花器官發(fā)育決定因子）[3]和Serum Response Factor（人類(lèi)血清反應(yīng)因子SRF4）[4]4個(gè)基因的研究中確定其存在，因此，取各基因的首字母而命名為MADS-box基因家族。

前人對(duì)于MADS-box基因的研究最早是從擬南芥和金魚(yú)草的花形態(tài)突變體開(kāi)始的[5]，深入研究后，不僅從番茄[6]、葡萄[7]、荷花[8]、小麥[9]等植物中克隆出MADS-box基因家族相關(guān)基因，還發(fā)現(xiàn)MADS-box基因除了與花形態(tài)建成調(diào)控[10]有關(guān)外，還在促進(jìn)根的形成[11]、分生組織的分化[12]、開(kāi)花時(shí)間的調(diào)控[13]、花粉成熟[14]、種子和果實(shí)發(fā)育成熟[15-16]等眾多方面發(fā)揮著重要作用，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

在橡膠樹(shù)MADS-box基因家族的相關(guān)研究中，Dornelas等[17]發(fā)現(xiàn)HbLFY基因在產(chǎn)生花序的側(cè)分生組織和所有花分生組織中均有表達(dá)，推測(cè)HbLFY與植物開(kāi)花相關(guān);華玉偉等[18]對(duì)HbFCA基因進(jìn)行克隆與功能分析，推測(cè)HbFCA基因參與植物開(kāi)花起始的調(diào)節(jié);王輝等[19]克隆了MADS27基因，推測(cè)在開(kāi)花過(guò)程中起調(diào)控作用;魏利然等[20]對(duì)HbMADS4基因進(jìn)行克隆與功能分析，推測(cè)其作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子調(diào)控合成天然橡膠;王亞杰[21]克隆并功能驗(yàn)證了MADS-box家族的26個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)該家族相關(guān)基因在莖尖、花器官顯著高調(diào)表達(dá)，推測(cè)其在花形態(tài)建成和生殖發(fā)育過(guò)程中起顯著作用。

本研究以巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97品種古銅期嫩葉為材料，制備染色體標(biāo)本，利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)MADS-box基因家族中的HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1共6個(gè)基因進(jìn)行染色體定位，從而揭示MADS-box基因家族分別在細(xì)胞核染色體上的實(shí)際位置，同時(shí)分析各個(gè)基因之間的分布特點(diǎn)，這有利于完善功能基因的分子細(xì)胞遺傳學(xué)信息，為MADS-box基因功能研究提供新的理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以橡膠樹(shù)無(wú)性系‘熱研7-33-97古銅期葉片稍微展開(kāi)的嫩葉為材料;應(yīng)在天氣晴朗且光照充足的上午采摘樣品。DNA提取材料為黃綠色（減少DNA提取時(shí)色素的污染）的橡膠樹(shù)嫩葉（圖1B）。制備染色體標(biāo)本的橡膠樹(shù)古銅期嫩葉（圖1A）應(yīng)先于飽和對(duì)二氯苯溶液中浸泡2 h，清洗至無(wú)味后，使用雙蒸水低滲處理30～60 min;棄雙蒸水，轉(zhuǎn)入卡諾式固定液（無(wú)水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中于4 ℃冰箱內(nèi)固定12～20 h;棄固定液，使用75%、90%和100%酒精各脫水5 min，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇溶液中于?20 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 染色體標(biāo)本的制備? 染色體標(biāo)本的制備主要參照高和瓊等[22]和李懋學(xué)等[23]的方法，以巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97品種古銅期嫩葉為材料，取有絲分裂旺盛的葉邊緣進(jìn)行染色體標(biāo)本制備，然后將制備好的染色體標(biāo)本進(jìn)行下一步熒光原位雜交（FISH）或存放于?20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2? 特異性引物的設(shè)計(jì)與篩選? 根據(jù)MADS- box基因家族中6個(gè)基因的登錄號(hào)在NCBI上找到目的基因序列，利用NCBI上在線(xiàn)比對(duì)軟件BLAST程序進(jìn)行序列同源性比對(duì)，找到序列比對(duì)同源性最高的（98%以上）巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97品種全基因組序列。使用Primer Permier 5設(shè)計(jì)引物。以橡膠樹(shù)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，48～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃后延伸7 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，檢驗(yàn)產(chǎn)物是否為單一條帶。單一條帶且長(zhǎng)度符合的PCR產(chǎn)物測(cè)序后用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，判斷是否符合引物的特異性。最后將6個(gè)對(duì)應(yīng)基因PCR擴(kuò)增單一目的條帶產(chǎn)物純化，檢測(cè)其濃度，于?20 ℃保存。篩選得到特異性引物見(jiàn)表1。

1.2.3? 探針的制備? 將擴(kuò)增純化后的6個(gè)基因的特異DNA序列中HbAGL8、HbTT16和HbAP1基因用生物素切口平移（BIO-Nick Translation Mix）試劑盒標(biāo)記成探針，信號(hào)位點(diǎn)呈紅色。HbAG15、HbAGL30和HbSVP1基因用地高辛切口平移（DIG-Nick Translation Mix）試劑盒標(biāo)記成探針，信號(hào)位點(diǎn)呈綠色。探針純化后于?20 ℃保存待用。

1.2.4? 熒光原位雜交? 參照官錦燕[24]的方法，并稍作改進(jìn)，操作如下：首先將染色體形態(tài)良好且分散的染色體標(biāo)本于70 ℃烘箱中恒溫處理2 h左右，起牢化作用，做好標(biāo)記區(qū)分正面;37 ℃下使用10 mg/mL RNA酶溶液處理1 h，減少雜信號(hào)影響，使特異信號(hào)清晰;在70 ℃預(yù)熱后的70%去離子甲酰胺中變性5 min后快速放入預(yù)冷的70%、90%和100%酒精各脫水5 min，用冷風(fēng)吹干;滴加45 μL經(jīng)變性處理后的雜交液[50%去離子甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，2×SSC（檸檬酸緩沖液），0.5 mg/mL鮭魚(yú)精DNA，20 ng/μL已標(biāo)記探針]在標(biāo)本正面中央，蓋上蓋玻片并用指甲油封片后放入雜交儀中，先于90 ℃變性10 min，后于37 ℃孵育16～24 h;孵育結(jié)束后用刀片輕輕揭開(kāi)蓋片，依次在2×SSC溶液中洗滌10 min、20%去離子甲酰胺（42 ℃）靜置10 min、2×SSC溶液中洗滌5 min，1×PBS溶液中洗滌5 min。

級(jí)聯(lián)熒光信號(hào)顯示與放大操作如下：首先滴加50 μL由終濃度為20 μg/mL鼠抗地高辛-Alexa Fluor488、終濃度為10 μg/mL鏈親和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）和1%牛血清白蛋白（中文名稱(chēng)）配制成的混合液，孵育1 h;然后滴加總體積50 μL的終濃度為20 μg/mL兔抗鼠-Alexa Fluor 488[Alexa Fluor 488-Affinipure Rabbit Anti-Mouse IgG （H+L）]、終濃度為10 μg/mL生物素化抗鏈親和素（Biotinylated Anti-streptavidin）和1% BSA配制成的混合液，孵育40 min;再次滴加總體積50 μL的終濃度為20 μg/mL鼠抗兔- Alexa Fluor 488（Alexa Fluor 488-Affinipure Mouse Anti-Rabbit）、終濃度為10 μg/mL鏈親和素（Alexa Fluor 594-Streptavidin）孵育和1% BSA配制成的混合液，孵育40 min，在每次孵育過(guò)后都需經(jīng)過(guò)1×PBS洗滌各3次，洗滌過(guò)程均需在水平搖床（WD-9405B型）上中速震蕩洗滌，每次洗滌時(shí)間分別是5、5、8 min。最后用40 μL 10 μg/mL的DAPI（抗淬滅劑稀釋?zhuān)┤旧?，蓋上蓋片并用指甲油封片。實(shí)驗(yàn)過(guò)程在避光條件下進(jìn)行。

1.2.5? 鏡檢與分析? 在雜交后的染色體標(biāo)本正面滴加適量的鏡油后，用熒光顯微鏡（型號(hào)BX51TR-32FA1-A03）觀察，選擇WBV熒光激發(fā)塊，用Image-Pro Plus軟件中文版6.0進(jìn)行拍照保存，第3通道觀察對(duì)染色體進(jìn)行拍照，染色體呈藍(lán)色，第2通道觀察生物素標(biāo)記的雜交位點(diǎn)為紅色，第1通道觀察地高辛標(biāo)記的雜交位點(diǎn)為綠色，用Photoshop CS6軟件和Adobe Illustrator CS6軟件處理圖片。

依照Song等[25]發(fā)布的信號(hào)位點(diǎn)百分距計(jì)算方法和高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數(shù)結(jié)合分析，本研究擴(kuò)增信號(hào)位點(diǎn)在染色體上的位置用擴(kuò)增信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離來(lái)衡量。公式如下：

2? 結(jié)果與分析

2.1? HbAGL8和HbAGL15基因的FISH檢測(cè)與物理定位分析

制作探針時(shí)，HbAGL8目的序列用生物素標(biāo)記，HbAGL15目的序列用地高辛標(biāo)記，然后進(jìn)行雙探針熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)其在染色體上的實(shí)際位置。雜交檢測(cè)過(guò)程中2個(gè)基因的信號(hào)位點(diǎn)在細(xì)胞分裂間期、前期和中期均能同時(shí)檢測(cè)到，并且紅色和綠色熒光位點(diǎn)明顯分布在不同的染色體上（圖2A、圖2B、圖2C）;陰性對(duì)照試驗(yàn)中，不加入探針進(jìn)行熒光原位雜交，用熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)檢測(cè)不到任何熒光信號(hào)（圖2D）。以高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數(shù)為依據(jù)，進(jìn)行中期染色體核型分析，得到核型圖（圖2E）和核型模式圖（圖5）。結(jié)果表明，HbAGL8定位在5號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離平均值為39.71;HbAGL15位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離平均值11.85。

2.2? HbAGL30和HbTT16基因的FISH檢測(cè)與物理定位分析

制作探針時(shí)，HbTT16目的序列用生物素標(biāo)記，HbAGL30目的序列用地高辛標(biāo)記，進(jìn)行雙探針熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其在染色體上的實(shí)際位置。雜交檢測(cè)過(guò)程中2個(gè)基因的信號(hào)位點(diǎn)在細(xì)胞分裂間期、前期和中期均能同時(shí)檢測(cè)到，并且紅色和綠色熒光位點(diǎn)明顯分布在不同的染色體上（圖3A、圖3B、圖3C）;陰性對(duì)照試驗(yàn)中，不加入探針進(jìn)行熒光原位雜交，用熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)檢測(cè)不到任何熒光信號(hào)（圖3D）。以高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數(shù)為依據(jù)，進(jìn)行中期染色體核型分析，得到核型圖（圖3E）和核型模式圖（圖5）。結(jié)果表明：HbTT16定位在1號(hào)染色體短臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離平均值為22.19;HbAGL30位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離平均值48.94。

2.3? HbAP1和HbSVP1基因的FISH檢測(cè)與物理定位分析

制作探針時(shí)，HbAP1目的序列用生物素標(biāo)記，HbSVP1目的序列用地高辛標(biāo)記，進(jìn)行雙探針熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其在染色體上的實(shí)際位置。雜交檢測(cè)過(guò)程中2個(gè)基因的信號(hào)位點(diǎn)在細(xì)胞分裂間期、前期和中期都能同時(shí)檢測(cè)到，并且紅色和綠色熒光位點(diǎn)明顯分布在不同的染色體上（圖4A、圖4B、圖4C）;陰性對(duì)照試驗(yàn)中，不加入探針進(jìn)行熒光原位雜交，用熒光顯微鏡檢測(cè)時(shí)檢測(cè)不到任何熒光信號(hào)（圖4D）。以高和瓊等[26]分析的‘熱研7-33-97品種的核型所得的核型參數(shù)為依據(jù)，進(jìn)行中期染色體核型分析，得到核型圖（圖4E）和核型模式圖（圖5）。結(jié)果表明：HbAP1定位在13號(hào)染色體短臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離平均值為18.01;HbSVP1位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，信號(hào)位點(diǎn)到著絲粒的百分距離平均值6.70。

3? 討論

3.1? 不同功能基因在橡膠樹(shù)中的連鎖關(guān)系

通過(guò)把巴西橡膠樹(shù)MADS-box基因家族中的6個(gè)成員（HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbSVP1和HbAP1）序列用DNAMAN分別兩兩進(jìn)行序列比對(duì)，它們的相似度均在24.48%～ 66.40%之間，這說(shuō)明它們之間的同源性不高，因此可利用原位雜交技術(shù)對(duì)這6個(gè)MADS-box基因家族成員進(jìn)行物理定位分析，確定其在染色體上的具體位置。

本研究結(jié)果表明，已定位的MADS-box基因家族中的6個(gè)成員均位于不同的染色體上，遺傳上可能互為獨(dú)立基因的關(guān)系（圖5）。結(jié)合前人已完成的其他功能基因定位的結(jié)果，可以得出：HbAGL15與HbWRKY7[27]、GGPS[28]、HbJAZ1、HbJAZ2[29]、HbCOI1[30]同時(shí)位于第4號(hào)染色體上;HbAGL8與HblMYC4[31]、HbRZF3[32]、HbNIN1[33]、HbMyb1[34]、HbNAC1[35]同時(shí)位于第5號(hào)染色體上;HbAGL30與HbWRKY75[27]、HEV1.2[36]、HbPT3[28]、HbRZF4[32]、HbSUT4[24]同時(shí)位于第7號(hào)染色體上;HbTT16與HbJAZ7[29]、HRT2[28]均位于第1號(hào)染色體上;HbAP1與HbWRKY2[27]、HblMYC3[31]、HbJAZ3[29]、SRPP[37]、HEV1.1[36]同時(shí)位于第8號(hào)染色體上。這些位于同一條染色體上的基因在遺傳上可能互為連鎖基因。

3.2? 在橡膠樹(shù)基因組組裝中的輔助作用

隨著全基因組測(cè)序工作的不斷推進(jìn)，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所于2016年5月完成了巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97品種的測(cè)序工作，并發(fā)布了其基因組草圖[38]。但目前只是將contig（重疊群）拼接為大片段的scaffold，而眾多scaffold尚未確定在哪條染色體上，故染色體歸類(lèi)并不清楚。本研究將MADS-box基因家族中的6個(gè)成員HbAGL8、HbAG15、HbAGL30、HbTT16、HbAP1和HbSVP1基因的序列在NCBI中與巴西橡膠樹(shù)‘熱研7-33-97品種的全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，這6個(gè)成員分別位于全基因組中的scaffold0520、scaffold0451、scaffold2068、scaffold0063、scaffold1741和scaffold0673片段上。根據(jù)本研究對(duì)MADS-box基因家族中的6個(gè)成員定位的結(jié)果，可初步判定scaffold0451、scaffold0520、scaffold2068和scaffold0673分別位于第4、5、7和8號(hào)染色體長(zhǎng)臂上;scaffold0063和scaffold1741分別位于第1和13號(hào)染色體短臂上。因此，本研究結(jié)果可為橡膠樹(shù)基因組scaffold序列的染色體歸屬提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

3.3? 對(duì)比分子標(biāo)記基因定位的優(yōu)勢(shì)

用現(xiàn)有分子標(biāo)記也能進(jìn)行基因定位，關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括：（1）根據(jù)遺傳材料之間的多態(tài)性確定親本組合，建立作圖群體;（2）群體中不同植株的標(biāo)記基因型的分析;（3）標(biāo)記間連鎖群的確定。其中構(gòu)建分離群體是作圖成功的關(guān)鍵[39]。選擇合適的分子標(biāo)記對(duì)群體中所有個(gè)體進(jìn)行基因型分析，通過(guò)親代與子代表現(xiàn)型的分離比例，可以判定基因與標(biāo)記基因的連鎖關(guān)系，從而確定基因與連鎖群的連鎖關(guān)系，其他功能基因也需要使用同樣方法才能確定與連鎖群的連鎖關(guān)系，才能得知不同基因間的連鎖關(guān)系，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力和物力。但通過(guò)物理定位僅需將染色體標(biāo)本通過(guò)FISH的方式，確定基因在染色體上的真實(shí)位置，通過(guò)其位置關(guān)系來(lái)初步推測(cè)它們的遺傳關(guān)系，初步判斷它們是否存在連鎖，以及它們與其他已定位基因的連鎖關(guān)系，更快更容易就能知道這些基因的遺傳關(guān)系。

本研究所揭示的MADS-box基因家族中的6個(gè)基因分別在細(xì)胞核染色體上的物理位置，以及它們與其他已定位基因之間的位置關(guān)系，有助于進(jìn)一步了解這些基因間可能的遺傳關(guān)系，彌補(bǔ)了MADS-box基因家族分子細(xì)胞遺傳學(xué)信息的空白，可為該基因家族在橡膠樹(shù)分子調(diào)控機(jī)理的研究提供細(xì)胞核位置信息，從而為橡膠樹(shù)分子輔助育種提供有力的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

Passmore S， Maine G T， Elble R， et al. Saccharomyces cerevisiae protein involved in plasmid maintenance is necessary for mating of MATα cells[J]. Journal of Molecular Biology， 1988， 204（3）： 593-606.

Yanofsky M F， Ma H， Bowman J L， et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors[J]. Nature， 1990， 346（6279）： 35-39.

Huijser P. Deficiens， a homeotic gene involved in the control of flower morphogenesis in Antirrhinum majus： The protein shows homology to transcription factors[J]. EMBO Journal， 1990， 9（3）： 605-613.

Norman C， Runswick M， Pollock R， et al. Isolation and properties of cDNA clones encoding SRF， a transcription factor that binds to the c-fos serum response element[J]. Cell， 1988， 55（6）： 989-1003.

黃? 方， 遲英俊， 喻德躍. 植物MADS-box基因研究進(jìn)展[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 35（5）： 9-18.

楊貞妮. 番茄MADS-box基因TAGL104的克隆及功能研究[D]. 重慶： 重慶大學(xué)， 2017.

宗成文， 房經(jīng)貴， 陶建敏， 等. 葡萄MADS-box家族基因保守片段的克隆與序列分析[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2008， 25（1）： 27-32.

王? 婧. 荷花MADS-box基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（1）： 39-42.

Khattak B. 小麥MADS-Box基因家族全基因組分析[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2017.

Mandel M A， Yanofsky M F. The Arabidopsis AGL9 MADS-box gene is expressed in young flower primordia[J]. Sex Plant Reprod， 1998， 11（1）： 22-28.

Alvarez-Buylla E R. MADS-box gene evolution beyond flowers： Expression in pollen， endosperm， guard cells， roots and trichomes[J]. The Plant Journal， 2000， 24（4）： 457-466.

Weigel D， Nilsson O. A developmental switch sufficient for flower initiation in diverse plants[J]. Nature， 1995， 377 （6549）： 495-500.

Seung Kwan Yoo， Jong Seob Lee， Ji Hoon Ahn. Overexpression of AGAMOUS-LIKE 28 （AGL28） promotes flowering by upregulating expression of floral promoters within the autonomous pathway[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication， 2006， 348（3）： 929-936.

Adamczyk B J， Fernandez D E. MIKC* MADS domain heterodimers are required for pollen maturation and tube growth in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2009， 149（4）： 1713-1723.

Buchner P， Boutin J P. A MADS-box transcription factor of the AP1/AGL9 subfamily is also expressed in the seed coat of pea （Pisum sativum） during development[J]. Plant Molecular Biology， 1998， 38（6）： 1253-1255.

Gu Q， C Ferrándiz， Yanofsky M F， et al. The FRUITFULL MADS-box gene mediates cell differentiation during Arabidopsis fruit development[J]. Development， 1998， 125（8）： 1509-1517.

Dornelas M C. Martinelli R A P. The rubber tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.） homologue of the LEAFY/ FLORICAULA gene is preferentially expressed in both male and female floral meristems[J]. Journal of Experimental Botany， 2005， 56（417）： 1965-1974.

華玉偉， 孫? 芳， 黃天帶， 等. 橡膠樹(shù)HbFCA啟動(dòng)子的克隆及其在橡膠樹(shù)中的表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（5）： 800-806.

王? 輝， 李? 琳， 梁? 正， 等. 巴西橡膠樹(shù)MADS-27基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 33（12）： 19-24.

魏利然， 李輝亮， 郭? 冬， 等. 巴西橡膠樹(shù)HbMADS4的克隆及原核表達(dá)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2015， 36（5）： 888-894.

王亞杰. 巴西橡膠樹(shù)MADS-box基因家族的克隆、表達(dá)譜分析及功能驗(yàn)證[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2017.

高和瓊， 王? 英， 金? 鴿， 等. 橡膠樹(shù)葉片染色體制片方法的優(yōu)化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（5）： 565-569.

李懋學(xué)， 張敩方. 植物染色體研究技術(shù)[M]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)出版社， 1991.

官錦燕. 巴西橡膠樹(shù)SUT和RZF基因家族物理定位的研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2014.

Song Y C， Gustafson J P. The physical location of fourteen RFLP markers in rice （Oryza sativa L.）[J]. Theoretical and Applied Genetics， 1995， 90（1）： 113-119.

高和瓊， 莊南生， 王? 英， 等. 橡膠樹(shù)兩個(gè)品種的核型分析[J]. 武漢植物學(xué)研究， 2009， 27（5）： 537-540.

劉正林， 莊南生， 王? 英， 等. 巴西橡膠樹(shù)HbWRKY基因家族10個(gè)成員在染色體上的定位[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2018， 19（6）： 1170-1179.

張新新. 巴西橡膠樹(shù)4個(gè)膠乳生物合成相關(guān)基因的物理定位研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2013.

李曉燕， 蘇莉莉， 高佳佳， 等. JAZ基因家族6個(gè)成員在橡膠樹(shù)上的物理定位[J]. 分子植物育種， 2017， 15（12）： 4992-4999.

高佳佳. 巴西橡膠樹(shù)幾個(gè)與橡膠合成相關(guān)基因的物理定位研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2014.

高? 豫， 莊南生， 王? 英， 等. MYC基因家族5成員在巴西橡膠樹(shù)染色體上的物理定位[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2018， 9（2）： 163-169.

官錦燕， 王? 英， 高和瓊， 等. 巴西橡膠樹(shù)4個(gè)環(huán)鋅指蛋白基因（HbRZF）的物理定位[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2014， 33（3）： 610-616.

高佳佳， 王? 英， 高和瓊， 等. 巴西橡膠樹(shù)膠乳轉(zhuǎn)化酶HbNIN基因家族物理定位的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2014， 35（9）： 1704-1709.

高和瓊. 巴西橡膠樹(shù)HbMyb1基因和OPV-10_（390）連鎖標(biāo)記原位PCR定位的研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2008.

楊光涌， 鄭? 菲， 王? 英， 等. 巴西橡膠樹(shù)NAC基因家族5個(gè)成員的熒光原位雜交物理定位[J]. 分子植物育種， 2018， 16（2）： 512-517.

彭寶豐， 王? 英， 高和瓊， 等. 橡膠素基因家族4個(gè)成員在橡膠樹(shù)染色體上的定位[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)， 2016， 7（3）： 318-324.

官錦燕. 巴西橡膠樹(shù)SUT和RZF基因家族物理定位的研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2014.

Tang C R， Yang M， Fang Y J， et al. The rubber tree genome reveals new insights into rubber production and species adaptation[J]. Nature Plants， 2016， 2（6）： 16073.

趙淑清， 武維華. DNA分子標(biāo)記和基因定位[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2000（6）： 1-4.