檳榔Catalase基因的克隆及亞細胞定位

梁婷 沈文濤 庹德財 言普 黎小瑛 唐慶華 周鵬

摘? 要：過氧化氫酶（Catalase）廣泛存在于生物體內，主要功能是清除植物細胞內光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪β-氧化等過程中產生的H2O2，從而保護細胞免于過氧化氫酶的毒害。為了解檳榔過氧化氫酶基因的相關信息，利用植物總RNA提取試劑盒提取檳榔葉片總RNA，通過同源克隆和RACE技術獲得檳榔全長cDNA，并對其進行生物信息學分析及亞細胞定位。結果表明：獲得ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN692601）、ArCAT3（MN692602）3個同源基因，其序列全長均為1476 bp，編碼492個氨基酸。遺傳進化分析顯示，ArCATS與同為棕櫚科的油棕（Elaeis guineensis）、海棗（Phoenix dactylifera）等植物的過氧化氫酶氨基酸序列具有較高的相似性，其中與油棕的親緣關系最近。亞細胞定位結果表明，ArCAT1蛋白定位于過氧化物酶體中，而ArCAT2和ArCAT3既定位于過氧化物酶體又定位于細胞核中。這為進一步研究Catalase基因在檳榔中的生物學功能奠定基礎。

關鍵詞：檳榔;過氧化氫酶;亞細胞定位;基因克隆

中圖分類號：Q23? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： The main function of catalase， widely existed in organisms， is to remove H2O2 produced in the process of photorespiration， mitochondrial electron transmission and fat betao-oxidation in plant cells to protect cells from the toxicity of H2O2. In order to understand the relevant information of areca catalase gene， RNA was extracted from areca leaves， the full length of areca cDNA was obtained through the homologous cloning and RACE technology， and bioinformatics analysis and subcellular localization were performed. The results showed that the total length of ArCAT1 （MN692600）， ArCAT2 （MN692601） and ArCAT3 （MN692602） gene sequence was 1476 bp， which could encode 492 amino acids. Genetic evolutionary analysis showed that ArCATS was closely related to Elaeis guineensis and Phoenix dactylifera. The results of subcellular localization showed that ArCAT1 protein was located in the peroxidosome， ArCAT2 and ArCAT3 were located in the peroxidosome and nucleus. This would lay foundation for further research on the biological function of the gene.

Keywords： Areca catechu L.; catalase; subcellular localization; gene cloning

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.002

過氧化氫酶是抗氧化酶中首先被發現的一類末端氧化酶，Loew[1]將其命名為Catalase，是由4個相同肽鏈亞基組成的四聚體血紅素酶，它也是一種高度保守的金屬酶，具有保守的活化中心和鐵血紅蛋白結合位點，存在于許多好氧和厭氧生物中，包括細菌、真菌、植物和動物細胞，在植物體內主要存在于過氧化物酶體、乙醛酸循環體和細胞質中，少數分布在線粒體中[2]，主要功能是清除植物細胞內光呼吸、線粒體電子傳遞及脂肪β-氧化等過程中產生的H2O2，從而保護細胞免于過氧化氫酶的毒害[3]。通過提高植物體內抗氧化酶活性，增強抗氧化代謝水平，可提高植物自身的抗逆性[4]。Catalase與超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸酶（APX）被稱為抗氧化酶保護系統[4]。近年來，已有研究結果發現，Catalase在植物生長發育、逆境脅迫防御應答、氧化衰老等生理過程中起著至關重要的作用[2]。Catalases家族由多基因編碼，其表達和活性受許多因素的影響，如溫度、光照、干旱、高鹽、重金屬等及生物因子等的影響[2]。目前已經在煙草[5]、擬南芥[6]、玉米[7]、南瓜[8]和水稻[9]等被子植物中發現了3種過氧化氫酶基因。在煙草中發現的3種過氧化氫酶中，CAT1負責清除光呼吸產生的H2O2，CAT2則清除氧化脅迫產生的H2O2，CAT3主要清除乙醛酸循環體中產生的H2O2[10]。

檳榔（Areca catechu L.）是檳榔屬棕櫚科檳榔亞科檳榔族檳榔亞族的常綠喬木，是一種典型的熱帶植物，一般生長于高溫高濕的熱帶雨林中，在低海拔、溫差變化不大的地區會生長得更好，原產于馬來西亞，中國主要分布在云南、海南及臺灣等熱帶地區、亞洲熱帶地區。檳榔含有生物堿、鞣質、黃酮、萜類等多種化學成分，是重要的中藥材，具有祛痰止咳、消積、下氣、行水、消腫、截瘧、消食醒酒、寬胸止吐、驅蟲等作用，是我國重要的四大南藥資源之一，經濟價值很高，在南方一些少數民族還有將果實作為一種咀嚼嗜好品，可御寒和消除緊張勞動后的疲勞，檳榔樹易發生的病害有葉斑病、葉枯病、炭疽病、疫病、果穗枯萎病、葉細菌性條斑病、芽腐病、黃化病等[11-14]。已有研究結果表明，Catalase參與了許多植物的抗病反應，過表達Catalase可提高植物的抗逆性，通過增強抗氧化酶活性及增強活性氧代謝來增強植物的耐受性，但未見檳榔樹在此方面的研究報道。本研究利用檳榔葉片提取RNA，通過同源克隆和RACE技術獲得檳榔過氧化氫酶全長cDNA，并對其進行生物信息學分析及亞細胞定位，這為進一步研究過氧化氫酶基因在檳榔中的生物學功能和培育優質抗性的檳榔品種奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以‘熱研1號檳榔（Areca catechu L.）為供試材料，采自中國熱帶農業科學院椰子研究所的檳榔園。將檳榔葉片剪碎后，在液氮中快速研磨至粉末狀，于?80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.2? 方法

1.2.1? 葉片總RNA的提取及cDNA合成? 采用RNA Prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取檳榔葉片總RNA。RNA提取后，用1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量核算蛋白測定儀檢測RNA的質量和純度。按照Prime ScriptTM cDNA第一鏈合成試劑盒說明書方法將RNA反轉錄成cDNA，于?20 ℃保存備用。

1.2.2? 候選基因的同源克隆? 利用GenBank數據庫中與檳榔同為棕櫚科的油棕（Elaeis guineensis）的ElCAT1（XM010919942.3）、ElCAT2（NM 001319913.1）、ElCAT3（XM010943120.3）的氨基酸序列，設計特異性引物CAT1F/CAT1R、CAT2F/CAT2R、CAT3F/CAT3R（表1），以基因組cDNA為模板，使用Prime STAR Max Premix （2） 高保真DNA聚合酶進行基因全長序列的擴增：98 ℃ 30 s;98 ℃ 15 s，53 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，擴增30個循環。擴增后的PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit試劑盒（諾唯贊公司）回收目的基因片段，回收產物連接TA-Blunt載體（TaKaRa），并轉化至DH5α大腸桿菌感受態中，挑選陽性克隆送賽默飛世爾科技有限公司進行測序。將測序正確的菌液提取質粒并于?80 ℃保存備用。

1.2.3? 目的基因全長序列克隆? 根據1.2.2測序所獲得的CAT1、CAT2、CAT3序列，設計3RACE引物和5 RACE引物，按照FirstChoice? RLM- RACE Kit試劑盒說明書進行3 RACE PCR和5 RACE PCR，擴增后的PCR產物，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收后，回收產物與TA-Blunt載體連接后轉化大腸桿菌DH5α，涂板之后篩選陽性單克隆送廣州賽默飛世爾科技有限公司進行測序。

1.2.4? 生物信息學分析? 通過在線軟件（http：// www.bio-soft.net/sms/index.html）對檳榔過氧化氫酶蛋白序列進行比對。

在NCBI中下載與檳榔（Areca catechu L.）同為棕櫚科的油棕（Elaeis guineensis）和海棗（Phoenix dactylifera）的3種Catalase基因，利用MEGA 11.0軟件，采用Neighbor-Joiniing （N-J鄰近法）構建系統進化樹，Bootstrap值設置為1000。

利用在線軟件http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/中的INSP預測真核蛋白中的核定位信號。

1.2.5? 農桿菌轉化和亞細胞定位分析

（1）亞細胞定位載體的構建。根據1.2.3獲得的檳榔ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3編碼基因的全長序列，利用Nimble Cloning[15]法分別連接載體pNC-Green-SubC（圖1）和pNC-Green-SubN（圖2），使GFP熒光蛋白分別位于基因的C端和N端，后轉化至DH5α大腸桿菌感受態菌株上，挑選陽性克隆，經過菌液PCR鑒定后，挑選擴增條帶最亮且與目的基因大小一致的樣品送廣州賽默飛世爾科技有限公司測序。

（2）農桿菌的轉化。取1 μg質粒DNA加到100 μL農桿菌GV3101感受態細胞中，利用電擊法轉化農桿菌。加入700 μL LB液體培養基，28 ℃、180 r/min培養2 h后均勻涂布在含80 μg/mL卡那霉素和40 μg/mL利福平的平板上。28 ℃培養48 h形成單菌落。

（3）農桿菌注射本氏煙。挑取農桿菌單菌落接種于200 μL LB液體培養基中，28 ℃、180 r/min培養至OD600約為1.0。5000 r/min離心5 min棄上清，加入5 mL接種緩沖液（含有終濃度為10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L MES，pH5.7和100 μmol/L acetosyringone）輕輕懸浮，5000 r/min離心5 min棄上清，重新加入接種緩沖液至OD600在0.3～0.4左右即可，室溫靜置暗處理3 h，進行接種。用一次性注射器分別吸取1 mL菌液，取針頭在受體葉片上輕刺2～3個小孔，將注射器壓在針孔部位，以手指抵住葉片下部，輕輕用力將注射器內菌液壓送并滲透到葉片組織中，用記號筆在注射部位上做好標記。接種后的煙草25 ℃培養48 h，剪取注射部位15 mm2左右在激光共聚焦顯微鏡下觀察，通過綠色熒光蛋白基因在煙草葉片表皮細胞中的表達和定位分布情況對目的基因進行亞細胞定位分析。

2? 結果與分析

2.1? 目的基因全長序列的克隆

使用相應的引物進行RT-PCR（圖3）、3 RACE（圖4）和5 RACE（圖5）擴增，將擴增得到的片段進行拼接得到全長cDNA，并在NCBI數據庫中通過Blast比對，結果顯示與數據庫中存在的同一科的油棕的Catalases核酸序列具有高度的相似性，同源率分別為：ArCAT1與ElCAT1為95%，ArCAT2與ElCAT2為95%，ArCAT3與ElCAT3為96%，由此推斷克隆所得的序列為檳榔的Catalases編碼序列，分別命名為ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3，長度均為1476 bp，編碼492個氨基酸，并將所得序列在GenBank上登錄，登錄號分別為ArCAT1（MN692600）、ArCAT2（MN 692601）、ArCAT3（MN692602）。分析結果發現，ArCAT1與ArCAT2、ArCAT3的氨基酸序列同源率分別為79%和90%，ArCAT2與ArCAT3編碼的氨基酸序列同源率為77%;ArCAT1與ArCAT2、ArCAT3的核酸序列同源率分別為76%和85%，ArCAT2與ArCAT3的核酸同源率為76%。

2.2? ArCATS基因的生物信息學分析

通過對檳榔過氧化氫酶蛋白序列的比對，利用氨基酸序列比對分析ArCAT1、ArCAT2和 ArCAT3編碼的氨基酸序列（圖6），結果發現ArCAT1、ArCAT2和ArCAT3均具有與定位有關的三肽（圖6，box1、box2和box3）。

從圖7可看出，ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3分別與油棕的ElCAT1、ElCAT2、ElCAT3和海棗的PhCAT1、PhCAT2、PhCAT3聚在同一分支上，其中，ArCAT1、ArCAT3分別與ElCATI、ElCAT3聚在同一亞分支上，說明檳榔和油棕的親緣關系最近。

2.3? 亞細胞定位

利用http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/中的INSP預測真核蛋白中的核定位信號，在ArCAT2和ArCAT3中均發現了核定位信號的結構域（圖6中的box4）。亞細胞定位結果發現（圖8），無論GFP熒光蛋白位于基因的C端還是N端，對定位的結果均無影響。在ArCAT1、ArCAT2、ArCAT3中均可觀測到綠色熒光點狀物，這符合過氧化物酶體的定位特征。但ArCAT2和ArCAT3比較特殊，不僅定位在過氧化物酶體中，還定位在細胞核中，這與徐娟等[16]所報道的植物細胞Catalase主要分布在過氧化物酶體、乙醛酸循環體和細胞質中結論一致，說明ArCAT2和ArCAT3可能在細胞核和細胞質中均發揮重要的功能。

3? 討論

眾多研究結果表明，過氧化氫是植物發育和環境反應的重要信號分子，在煙草中發現的3種過氧化氫酶中，CAT1負責清除光呼吸產生的H2O2，CAT2則清除氧化脅迫產生的H2O2，CAT3主要清除乙醛酸循環體中產生的H2O2[5]。玉米CAT1和CAT3在籽粒發育過程中表達，而CAT2的表達在籽粒發育后期才可檢測到[17]。而這些過氧化氫蛋白酶主要存在于細胞質中的過氧化物酶體和乙醛酸循環體[18]。而本研究利用http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/預測真核蛋白中的核定位信號，在ArCAT2和ArCAT3中均發現了核定位信號的結構域（圖6，box4），表明ArCAT2和ArCAT3定位在細胞核中并有可能發揮著重要的功能，這有待于作進一步的研究，預期對檳榔Catalase基因（ArCAT）功能的探究提供重要的思路。

在本研究中，研究發現ArCAT1和ArCAT2中存在經典的P-T-S1基序S/N-R-L基序，而在ArCAT3中則存在T-R-F基序（圖6，box2），這些三肽并不位于末端的C端而是在上游-7至-9，這種內部定位的基序可能加強過氧化物酶體的導入，但其本身并不起作用。在N-R-L基序的上游是一個Q-K-L/I/V序列（圖6，box1）。據報道[19-20]，基因序列會影響它們之間的相互作用，基于目前對PTS1通路機制的了解，內部的Q-K-L序列似乎不太可能直接與PTS1受體蛋白Pex5p作用[21]。另一項研究得出結論，南瓜的過氧化物酶體中的CAT1積累需要PTS1通路機制[22]。雖然知道不同過氧化物酶體蛋白PTS1三肽表現出相當大的變異性，不過檳榔過氧化物酶的相應序列（圖6，box3）不屬于其列。盡管如此，研究發現為了將過氧化氫酶高效導入檳榔葉片細胞過氧化物酶體，C端三肽（圖6，box3）是必需的，這一研究結論為后續檳榔過氧化氫酶基因高效遺傳轉化體系的建立提供了重要的科學依據。

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