文心蘭類原球莖形態建成及電子傳遞蛋白和凱氏帶蛋白基因的極性表達模式分析

王雪晶 李蓉 王姍姍 張婧 林玉玲 陳裕坤 林爭春 陳青青 葉開溫 賴鐘雄 徐涵

摘? 要：以文心蘭‘檸檬綠（Oncidium hybridum ‘Honey Angel）為材料進行類原球莖發育過程的形態和結構觀察，對其離體形態建成進行分析，并對類原球莖（protocorm-like body， PLB）分化過程中的頂部和基部組織以及組培苗的根、莖、葉中的凱氏帶蛋白基因CASP和電子傳遞蛋白基因Fd（ferredoxin）、FNR（ferredoxin-NADP+ oxidoreductase）的表達模式進行分析。結果顯示：類原球莖在分化過程中逐步建立了兩極性。隨著類原球莖的發育，自頂端向基部形成維管形成層，繼而形成維管束;之后有葉原基產生并形成單子葉式莖尖結構和出現類原球莖胚軸的伸長，無胚根形成。類原球莖形成幼苗后植株基部有側根的產生。實時熒光定量PCR結果表明：在根中高表達和在莖中高表達的CASP、FNR和Fd基因在類原球莖不同發育階段和組織中存在極性的差異表達，參與了無胚根體細胞胚胎的生長發育過程。綜上所述，文心蘭體細胞胚在發育過程中從弱分化器官向莖葉器官轉變，形成蘭花特有的非同步體細胞胚胎發育現象——類原球莖。

關鍵詞：文心蘭;類原球莖;離體形態建成;體細胞胚胎發生

中圖分類號：S682.31? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： The morphology and structure of the protocorm-like body （PLB） of Oncidium hybridum ‘Honey Angel during development were observed and the PLB in vitro morphogenesis was analyzed. The expression patterns of CASP （Casparian strip membrane domain protein） and electron transfer genes Fd （ferredoxin） and FNR （ferredoxin-NADP + oxidoreductase） in PLBs， roots， stems， and leaves of in vitro cultured seedlings and PLB apical and basal tissues during the PLB differentiation were further analyzed. The results showed that the PLBs gradually established polarity during the differentiation in which a vascular bundle was formed from the PLB sub-apical area to the basal part. Later， a leaf primordium was generated and the monocotyledon shoot apical structure was formed. Root formation was in a lateral pattern and occurred after the PLB embryonic axis had significantly elongated. The basal tissue of the PLB did not develop any embryonic root. Lateral roots occurred in the seedling stage. It is concluded that the PLB development of O. hybridum is a type of asynchronous somatic embryogenesis， i，e， the embryonic root does not form during embryogenesis. Results of real-time quantitative PCR showed CASP， FNR and Fd genes showed differentially bipolar expressions in different developmental stages and tissues of PLBs， playing roles in the rootless PLBs morphogenesis. In summary， the somatic embryos of O. hybridum transform from weakly differentiated organs to shoot-like organs during development， forming an orchid-specific somatic embryogenic phenomenon， PLB.

Keywords： Oncidium hybridum; protocorm-like bodies; in vitro morphogenesis; somatic embryogenesis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.004

文心蘭（Oncidium hybridum）為蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬（Oncidium）具有較高觀賞價值的花卉[1-2]。但由于分株繁殖系數較低，目前主要利用組織培養技術對蘭花開展工廠化種苗生產[3]。文心蘭類原球莖的形成是蘭花離體培養過程中特有的發育現象，通過PLB的誘導和增殖可以在短時間內實現蘭花試管苗的大量繁殖[4]。原球莖是蘭科植物種子萌發產生的一種特殊結構，進一步發育成為完整植株[5]。類原球莖（protocorm-like bodies，PLBs）又稱擬原球莖，是用來描述蘭科植物組培過程中產生的類似種子中合子胚的結構。Morel在1960年進行虎頭蘭（Cymbidium hookerianum）莖尖培養時發現外植體上能夠形成類似原球莖的組織，將其命名為類原球莖。類原球莖可由植株的腋芽[6]、葉[7]、莖尖[8]、愈傷組織[9]等部位誘導產生。原球莖和類原球莖在植物學領域是一個研究的模式結構。大部分的胚和植株都具有根或根狀結構，以完成植物對土壤中養分的吸收。而蘭科植物的合子胚（又稱原球莖）和體細胞胚（又稱為類原球莖）不具有根或根狀結構，其根的出現要晚于莖端分生組織的分化。這是蘭科植物胚胎發生區別于其他被子植物的一個重要特點。其胚胎發生的極性在沒有根的參與下，如何建立，以及如何完成胚胎的分化和發育，迄今知之甚少。

鐵氧還蛋白（ferredoxin， Fd）和鐵氧還蛋白氧化還原酶（ferredoxin-NADP+ oxidoreductase， FNR）是高等植物中廣泛存在的電子傳遞蛋白，廣泛參與植物細胞的生理生化過程。Fd普遍存在于細菌、藻類及高等植物中[10]，參與NADP的再生、卡爾文循環以及細胞內ROS平衡的調控，此外，它還是亞硝酸鹽還原酶、谷氨酸合成酶以及脂肪酸去飽和酶等生物酶類的直接電子供體[11]。在文心蘭LFNR和RFNR的研究中表明FNR基因具有組織表達特異性，LFNR更多地在葉中表達，而RFNR則更多地在根中表達[12]。

根是植物吸收水分和養分的重要器官，對植物的生長發育起著至關重要的作用[13]。根的初生結構由外至內可分為表皮、皮層和維管柱3個部分。凱氏帶位于根的內皮層細胞，在細胞的上、下壁和徑向壁上，有木質化和栓質化的加厚，呈帶狀環繞細胞1周[14]。凱氏帶能夠調節離子的質外體吸收途徑，對離子的徑向運輸起阻滯作用，實現離子的選擇性吸收，同時凱氏帶還能夠阻止有毒物質的吸收和病原菌的入侵[15]。在被子植物中，凱氏帶主要存在于根的內、外皮層，大部分植物莖和葉中的內皮層中不存在凱氏帶[16]，但是，在豌豆黃化苗的莖中和天竺葵莖中木栓化細胞中發現有凱氏帶結構[17-18]，葉片內皮層凱氏帶加厚存在于一些草本植物中[19-20]。在蕨類植物葉的內皮層中普遍存在凱氏帶[16]，在部分華山松、白皮松等松杉類植物的葉內皮層中也具有凱氏帶[21-22]。凱氏帶與植物根的生長密切相關，凱氏帶蛋白（casparian strip membrane domain proteins， CASPs）被發現是特異性出現在凱氏帶形成區域的膜蛋白，它定位在凱氏帶形成的位置上[23]，但也沒有證據表明已發現的CASPs一定都不出現在其他部位。凱氏帶蛋白的差異表達分布模式分析，不僅可以揭示CASP的功能，而且可以進而對文心蘭類原球莖根的發育分子機制進行探索。目前，關于文心蘭類原球莖形態建成及極性建立的研究相對較少，其屬于器官發生途徑還是體細胞胚胎發生途徑迄今尚無定論。本試驗對類原球莖發生過程的形態學和細胞學特征進行研究，以及凱氏帶蛋白CASP和電子傳遞蛋白FNR、Fd基因在文心蘭類原球莖發育過程中的表達進行分析，為文心蘭類原球莖發生機理研究和形態調控提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以‘檸檬綠文心蘭為材料，由福建農林大學園藝植物生物工程研究所提供。取樣均3次重復，將所取樣品迅速放入液氮速凍后于?80 ℃冰箱保存備用。

1.2? 方法

1.2.1? 文心蘭形態及細胞結構觀察? 在文心蘭類原球莖組織培養中，將類原球莖用刀切成均等的小塊，接種于MS+蛋白胨1 g/L+土豆汁65 g/L+活性炭1 g/L+蔗糖20 g/L+瓊脂10 g/L培養基上進行培養，培養基pH為5.4，121 ℃高壓滅菌，培養條件為25 ℃，光照時間12 h/d。在表面會產生新的類原球莖，培養過程中進行連續觀察并取樣。取不同發育時期的材料，進行徒手切片的制作與觀察。

1.2.2? 總RNA的提取及cDNA的合成? 總RNA的提取按不同發育階段和組織區域進行取樣：組培苗的根、莖、葉（圖1A）;球形期類原球莖（圖1B）;莖尖形成階段的類原球莖（分化1，圖1C）;莖尖形成并伸長階段的類原球莖（分化2，圖1E）。

為研究莖尖和基本根的分化，在分化1階段中類原球莖上半部（分化1-上）和基部（分化1-下，圖1D），以及在分化2階段中類原球莖上半部（分化2-上）和基部（分化2-下，圖1F）的組織也進行分別的RNA提取。

參考Trizol（Invitroigen 公司）試劑盒的說明書提取樣品的總RNA，并用Thermo超微量核酸檢測儀測定RNA濃度，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度，用SYBR ExScriptTM（TaKaRa）試劑盒逆轉錄成cDNA用于實時熒光定量PCR分析 。

1.2.3? 文心蘭電子傳遞蛋白Fd和FNR基因及凱氏帶蛋白CASP基因的篩選? 本實驗室在文心蘭轉錄組中篩選并克隆了7條Fd基因和2條FNR基因。Fd基因分別為Unigene0000898、Unigene0012213、Unigene0012214、Unigene0013930、Unigene0016888、Unigene0020807、Unigene0038950[12]。FNR基因分為RFNR基因和LFNR基因。擬南芥網站下載獲得擬南芥CASP基因，pfam分析該家族基因具有DUF588結構域（PF04535）。在文心蘭轉錄組中篩選具有該結構域的基因，共獲得Unigene0017749、Unigene0017008、Unigene0005831、Unigene0005699、Unigen004691、Unigene002015、Unigene0019739、Unigen0006936、Unigene0014311、Unigene0006200、Unigene0019942、Unigene0017335、Unigene0017864和Unigene0018359這14條基因。

1.2.4? CASP基因及FNR和Fd基因表達特性分析? 運用羅氏LightCycler 480儀器，通過qPCR檢測CASP基因及FNR和Fd基因在文心蘭不同組織部位的表達情況。根據實時熒光定量PCR引物設計原則，設計CASP基因及FNR和Fd基因的qPCR引物（表1、表2），以及內參基因Actin的特異性引物Actin-Q-F和Actin-Q-R（表1）。采用SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ kit（TaKaRa）進行qPCR反應，反應體系為20 μL： SYBRⅡ酶10 μL，ddH2O 7.4 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.8 μL。反應條件為：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，45次循環。數據分析采用2?CT法獲得CASP基因及FNR和Fd 基因的相對表達量，采用SPSS 19.0對CASP基因及FNR和Fd 基因的表達分別進行差異顯著性分析，用ORIGIN 8.5進行繪圖。

為研究文心蘭Fd基因在植物進化過程中的保守性以及分類情況，選取擬南芥、水稻、玉米、菠蘿以及蝴蝶蘭5個物種的Fd基因編碼的氨基酸序列與文心蘭Fd基因編碼的氨基酸進行聚類分析，該基因家族可分為線粒體型和葉綠體型兩大類，其中葉綠體型的鐵氧還蛋白基因可分為FdC2、FdC1、Fds 3個亞支，Fds在植物鐵氧還蛋白基因中占據較大比例（圖6），且文心蘭Fd 基因在進化過程中與同為蘭科植物的蝴蝶蘭保持較近的親緣關系，進一步說明了Fd在植物中的保守性和普遍性[27]。

基本理化性質分析表明，除Unigene0013930為堿性蛋白，其余均為酸性蛋白，除Unigene0012213和Unigene0020807為穩定蛋白，其余均為不穩定蛋白，文心蘭Fd家族成員均無信號肽，均不形成螺旋卷曲螺旋結，Unigene0016888、Unigene0020807、Unigene0038950均有2個跨膜螺旋結構，只有Unigene0000898定位于線粒體，其余均定位于葉綠體。

2.5? 文心蘭CASP基因生物信息學分析

保守功能域分析結果表明CASP基因屬于MAEVEL超家族，包含DUF588結構域。對14個CASP基因序列生物信息學分析發現（表3），CASP蛋白序列的長度在179～331 aa之間，預測蛋白相對分子量（Mr）在19 117.23～36 824.78之間，等電點在5.04～10.17之間。根據預測的理論等電點發現有3個CASP蛋白為堿性蛋白，其余9個均為酸性蛋白;蛋白不穩定系數7個大于40，表明有7個CASP基因屬于不穩定蛋白，其余7個為穩定蛋白;平均親水系數2個為負值，表明有2個CASP蛋白是親水蛋白。二級結構分析發現，CASP蛋白中無規則卷曲所占的比例最大。

為研究文心蘭CASP在植物進化過程中的保守性，選取擬南芥、水稻、玉米、菠蘿和鐵皮石斛5個物種的CASP基因編碼的氨基酸序列與文心蘭CASP基因編碼的氨基酸序列進行聚類分析，圖7表明文心蘭CASP基因在進化過程中與鐵皮石斛和菠蘿有較近的親緣關系。

2.6? 文心蘭FNR和Fd基因在類原球莖分化過程中的表達分析

為研究類原球莖形態發生，總RNA根據發育階段和不同組織部位進行取樣如圖1所示。分析FNR和Fd基因在文心蘭類原球莖分化過程中及分化2個階段的頂部和基部組織的基因表達情況（圖8、圖9）。RFNR和LFNR在文心蘭分化的根、莖、葉、類原球莖及類原球莖分化的2個階段及分化2個階段的頂部和基部均有表達。RFNR在根中表達量是LFNR的2倍，RFNR在類原球莖中的表達量是LFNR的2.4倍。RFNR在文心蘭根、類原球莖、分化1階段、分化1階段的基部、分化2階段的基部表達量均高于LFNR的表達量。LFNR在葉、分化2、分化2的頂部表達量高于RFNR的表達量。在分化1階段的頂部RFNR和LFNR的表達量基本相同，因為此時類原球莖剛開始分化，頂部所占比例較少，因此二者表達量相當。

Fd基因在文心蘭類原球莖分化過程中及分化2個階段的頂部和基部組織的基因表達情況，結果見圖9。Unigene0000898和Unigene0020807在文心蘭根中的表達量高于莖和葉，在類原球莖中的表達量相比其他基因要高，在分化2的表達量高于分化1的表達量，在分化1-上、分化1-下、分化2-上和分化2-下中的表達量相差不多，其在類原球莖發育過程中可能主要在根的分化中起主要作用。Unigene0013930、Unigene0016888、Unigene0012213、Unigene0012214、Unigene0038950和Unigene0012214在莖、葉、分化2、分化1-上、分化2-上表達量高于其他組織部位，其在類原球莖發育過程中可能主要在莖葉的分化中起主要作用。

2.7? 文心蘭CASP基因在類原球莖分化過程中的表達分析

CASP在文心蘭類原球莖分化過程中及分化2個階段的頂部和基部組織的基因表達情況見圖10。Unigene0017335、Unigene0005699、Unigene0019739、Unigene0006936、Unigene0019942、Unigene0017864具有相似的表達模式，在根中的表達量高于莖和葉中的表達量;類原球莖及分化1和分化2表達量相當，分化1-上表達量略高于分化1-下，分化2-上表達量略高于分化2-下。Unigene0017008、Unigene0005831在葉中表達量高于根和莖中的表達量，在類原球莖中表達量最高，分化1和分化2表達量相當，分化1-上比分化1-下表達量高，分化2-上比分化2-下表達量高;Unigene004691、Unigene0017749、Unigene002015和Unigene0018359在葉中表達量高于根和莖中的表達量，在分化1表達量遠高于分化2，同時分化1-上和分化1-下的表達量高于分化2-上和分化2-下;Unigene0014311和Unigene0006200在不同組織部位中表達量呈本底表達。

2.8? 文心蘭類原球莖離體形態建成中極性和組織分化的量化分析

根據熒光定量PCR結果表明，歸類出根和莖葉中各基因成員的最高表達量分別是422和342，將相同基因成員在類原球莖中及各階段和組織中的表達量數據（圖8～圖10）進行量化比對，可以量化地計算出一個發育時期和各組織區域中根和莖葉中的表達量，從而定位其在坐標中的位置，顯示出其極性和組織分化的程度（圖11、圖12）。從PLB整體發育方面分析（圖11），球形期PLB接近根和莖的表達量中間，沒有明顯的極性。在PLB分化出莖尖時（分化-1），PLB向莖的方向分化，而根的方向減弱。在PLB分化出芽并伸長時（分化-2），根的分化加強，而莖的分化減弱。進一步研究發現（圖12），在PLB分化-1階段，PLB 上下兩部分組織也都偏向莖的方向分化;而在分化-2階段，PLB上部組織也保持向莖的方向分化，下部則向根的方向分化。因此，從基因差異表達的分析結果看，PLB產生胚根的極性生長力脆弱。

3? 討論

3.1? 文心蘭類原球莖的形態建成是沒有根的同步發生的體細胞胚胎發生

蘭科植物種子胚發育不全。在種子萌發過程中，種胚發育成原球莖，原球莖不斷發育，形成分生組織和薄壁細胞，分生區形成芽體，芽體由帶有莖尖的伸長的莖，但沒有根的形成，最后由側根的發生形成完整植株[28]。本研究通過觀察文心蘭類原球莖的形態建成，發現類原球莖的發育過程與蘭科植物種子胚發育過程相似。類原球莖從愈傷組織產生，形成只有原表皮和內部細胞形成的球形胚，之后上下兩端建立極性。類原球莖基部出現離散分布的假根毛，推測與根毛的功能相似[29-30]。類原球莖的中心部分靠上部的頂端形成有縱向伸長的形成層，在較成熟的區域形成維管束，維管束與葉原基相連。至此，雖然顯示出縱向的兩極分化，但沒有根的產生，形成類原球莖型的莖葉結構的幼苗。這在其他蘭科植物中也普遍存在[31-32]。因此，文心蘭類原球莖的形態建成是一種根不同步發生的非同步體細胞胚胎發生類型。

3.2? 基因特異性的差異表達可以定量地衡量文心蘭類原球莖的形態發生極性和程度

FNR和Fd是植物能量代謝的末端電子傳遞蛋白和電子供體[11， 33]。CASPs與根的凱氏帶形成具有特異相關性[23]。在本研究中，FNR和Fd基因及CASP基因在文心蘭不同發育時期和不同組織中的差異表達，顯示了文心蘭類原球莖的組織分化。

在水稻的研究中，OsCASP1在水稻的根中表達量最高;OsCASP1在水稻抽穗期的各個組織器官中均有表達，但在根中表達量高于其他組織器官，水稻根中CASP基因在根系選擇性吸收礦質元素特別是對Ca和Si的吸收起著重要作用[34]。根在植物生長中扮演重要角色，從土壤中吸收養分供植物生長，CASP主要存在于維管植物的根內皮層細胞中[23]。在擬南芥中，CASP在多種細胞類型中特異性表達[35]。其他的植物，尤其是單子葉植物，與擬南芥差異較大。其凱氏帶的形成和相關基因，也常會表現出其所在植物特有的結構和功能[36]。

為分析根的極性分化，本研究根據Fd、根型RFNR與葉型LFNR及CASP基因在根和莖端的差異性表達和在不同發育階段的極值計算，在分子水平揭示了電子載體類看家基因和凱氏帶相關的根的特異性基因都在類原球莖發育過程中處于莖葉的分化方向而不是根的分化方向;至發育后期，兩極分化才出現根的分化偏向（圖11、圖12）。

綜上所述，文心蘭體細胞胚在發育過程中從弱分化器官向莖葉器官轉變，形成蘭花特有體細胞胚胎發育現象——類原球莖。文心蘭類原球莖的形態建成是根不同步發生的非同步體細胞胚胎發生類型，直到類原球莖形成幼苗后才有側根的產生。雖然在類原球莖形態建成過程中并沒有根的產生，但是形態上有假根毛，結構上有維管束貫穿莖葉和基部，從基因表達譜上不出現根的空白表達。因此，推測類原球莖的基部具有部分根的功能。類原球莖在生長發育過程中組織分化和形態建成伴隨著基因的差異表達，顯示出定量的極性和分化偏向性。

參考文獻

羅遠華， 黃敏玲， 吳建設. 文心蘭育種研究進展[J]. 江西農業學報， 2012， 24（10）： 15-20.

Liu X J， Chuang Y N， Chiou C Y， et al. Methylation effect on chalcone synthase gene expression determines anthocyanin pigmentation in floral tissues of two Oncidium orchid cultivars[J]. Planta， 2012， 236（2）： 401-409.

崔廣榮. 文心蘭組織培養及轉基因研究進展[J]. 草業學報， 2010， 19（04）： 220-229.

張? 超， 王廣東. 文心蘭原球莖形態發生與可溶性物質及抗氧化酶的關系[J]. 西北植物學報， 2009， 29（8）： 1607- 1613.

Arditti J， Ghani A K A. Tansley review No. 110： Numerical and physical properties of orchid seeds and their biological implications[J]. New Phytologist， 2010， 145（3）： 367-421.

Huang C H， Chung J P. Efficient indirect induction of protocorm-like bodies and shoot proliferation using field-grown axillary buds of a Lycaste hybrid[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture （PCTOC），2011， 106（1）： 31-38.

Mayer J L S， Stancato G C， Appezzato-Da-Glória B. Direct regeneration of protocorm-like bodies （PLBs） from leaf apices of Oncidium flexuosum Sims （Orchidaceae）[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2010， 103（3）： 411-416.

Gantait S， Sinniah U R， Mandal N， et al. Direct induction of protocorm-like bodies from shoot tips， plantlet formation， and clonal fidelity analysis in Anthurium andreanum cv. CanCan[J]. Plant Growth Regulation， 2012， 67（3）： 257-270.

Zhao P， Wu F， Feng F S， et al. Protocorm-like body （PLB） formation and plant regeneration from the callus culture of Dendrobium candidum Wall ex Lindl[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant， 2008， 44（3）： 178-185.

Bertini I， Luchinat C， Provenzani A， et al. Browsing gene banks for Fe2S2 ferredoxins and structural modeling of 88 plant-type sequences： An analysis of fold and function[J]. Proteins Structure Function & Bioinformatics， 2002， 46（1）： 110-127.

Hemschemeier A， Happe T. Alternative photosynthetic electron transport pathways during anaerobiosis in the green alga Chlamydomonas reinhardtii[J]. Biochimica Et Biophysica Acta， 2011， 1807（8）： 919-926.

李? 蓉. CRISPR/Cas9介導的文心蘭Fd和FNR基因編輯研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2019： 43-44.

Ingram P， Dettmer J， Helariutta Y， et al. Arabidopsis lateral root development 3 is essential for early phloem development and function， and hence for normal root system deve lopment[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology， 2011， 68（3）： 455-467.

Enstone D E， Peterson C A， Ma F. Root endodermis and exodermis： Structure， function， and responses to the environment[J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2002， 21（4）： 335-351.

Alassimone J， Roppolo D， Geldner N， et al. The endodermis-development and differentiation of the plants inner skin[J]. Protoplasma， 2011， 249（3）： 433-443.

Lersten N R. Occurrence of endodermis with a casparian strip in stem and leaf[J]. Botanical Review， 1997， 63（3）： 265-272.

Meyer C J， Peterson C A. Casparian bands occur in the periderm of Pelargonium hortorum stem and root[J]. Annals of Botany， 2011（4）： 4.

Sack F D. The structure of the stem endodermis in etiolated pea seedlings[J]. Canadian Journal of Botany， 1987， 65（7）： 1514.

吳小琴， 朱錦懋， 王欽麗， 等. 植物凱氏帶的研究進展[J]. 植物學通報， 2002（3）： 302-309.

蔡? 霞， 吳小琴， 周慶源， 等. 植物內皮層凱氏帶及其在抗鹽脅迫中的作用[J]. 電子顯微學報， 2011， 30（6）： 533-540.

唐? 熙， 吳小琴， 胡玉熹， 等. 華山松根與針葉凱氏帶的比較研究[J]. 西北植物學報， 2004（8）： 1378-1383.

Wu X Q， Lin J X， Zhu J M， et al. Casparian strips in needles of Pinus bungeana： Isolation and chemical characterization[J]. Physiologia Plantarum， 2003， 117（3）： 421-424.

Roppolo D， De Rybel B， Dénervaud T V， et al. A novel protein family mediates Casparian strip formation in the endodermis[J]. Nature， 2011， 473（7347）： 380-383.

Rasmussen H N. Cell differentiation and mycorrhizal infection in Dactylorhiza majalis （Rchb. f.） Hunt & Summerh. （Orchidaceae） during germination in vitro[J]. New Phytologist， 2006， 116（1）： 137-147.

李? 蓉， 吳曉佩， 王雪晶， 等. 文心蘭RFNR的克隆、亞細胞定位及其與LFNR不同的脅迫響應機制研究[J]. 園藝學報， 2018， 5（11）： 2164-2176.

Hanke T G. A post genomic characterization of Arabidopsis ferredoxins[J]. Plant Physiology， 2004， 134（1）： 255-264.

Arnon I D. The discovery of ferredoxin： The photosynthetic path[J]. Trends in Biochemical Sciences， 1988， 13（1）： 30-33.

謝析穎. 霍山石斛生物鐘相關基因克隆及其與培養物糖含量分析[D]. 福州： 福建農林大學， 2017： 15-18.

王? 熊， 吳敦肅. 建蘭類原球莖體生長、發育過程中掃描電鏡觀察[J]. 植物生理學報， 1991（2）： 192-196.

陳進勇， 程金水. 幾種中國蘭種子試管培養根狀莖發生的研究[J]. 北京林業大學學報， 1998（1）： 35-38.

Roy J， Naha S， Majumdar M， et al. Direct and callus-mediated protocorm-like body induction from shoot-tips of Dendrobium chrysotoxum Lindl. （Orchidaceae）[J]. Plant Cell Tissue & Organ Culture， 2007， 90（1）： 31-39.

丁? 蘭， 李? 娟， 楊? 紅， 等. 離體條件下卡德麗亞蘭的形態建成[J]. 廣西植物， 2009， 29（3）： 382-385.

Mulo P. Chloroplast-targeted ferredoxin-NADP+oxidoreductase （FNR）： Structure， function and location[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Bioenergetics， 2011， 1807（8）： 927-934.

Wang Z G， Yamaji Naoki， Huang S， et al. OsCASP1 is required for Casparian strip formation at endodermal cells of rice roots for selective uptake of mineral elements[J]. The Plant Cell， 2019， 31（11）： 10.1105/tpc.19.00296.

Raven J A， Edwards D. Roots： Evolutionary origins and biogeochemical significance[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 52（suppl_1）： 381-401.

翁群清， 鄭秀娟， 解慧芳， 等. 植物凱氏帶形成分子機制及功能特點的研究進展[J]. 西北植物學報， 2017， 37（7）： 1450-1456.