響應面法優化香水蓮花甾醇的超聲提取工藝

付調坤 周偉 廖良坤 付瓊 李積華

摘? 要：為了分析香水蓮花的植物甾醇含量并優化其超聲提取工藝，采用高效液相色譜（HPLC）法測定香水蓮花中菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的含量，再以上述3種甾醇提取量為評價指標，對液料比、超聲提取溫度和超聲提取時間進行單因素試驗，在此基礎上，再采用Box-Behnken響應面法優化香水蓮花甾醇提取工藝并進行驗證。結果表明，影響香水蓮花甾醇提取量的主次因素是液料比>提取時間>提取溫度，其最優工藝條件為以95%乙醇為提取溶劑、超聲功率100 W、液料比30∶1（mL/g）、超聲提取溫度60 ℃、超聲提取時間30 min;在最優工藝條件下進行驗證實驗，得出香水蓮花中甾醇含量為菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/100 g，總甾醇204.42 mg/100 g，綜合評分與預測值相比差異不顯著（P<0.05）。研究結果為香水蓮花資源的開發和利用提供參考。

關鍵詞：香水蓮花;植物甾醇;超聲提取工藝;Box-Benhnken響應面法

中圖分類號：S59? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： To analyze the phytosterol content in Nymphaea hybrid and optimize its ultrasonic extraction technology， high performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted for content determination of brassicasterol， campesterol and β-sitosterol in N. hybrid， and the contents of above 3 components were taken as index to carry out single factor test on liquid-solid ratio， ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time. Based on that， Box-Behnken response surface method was used to optimize the extraction process parameter of N. hybrid sterols and the results were tested and verified. The results showed that the factors affecting the sterol amount extracted from N. hybrid were liquid- solid ratio > ultrasonic extraction time > ultrasonic extraction temperature. The optimal process is as follows： 95%?ethanol is used as extraction solvent， ultrasonic power is 100 W， liquid-solid ratio is 30∶1 （mL/g）， ultrasonic extraction?temperature is 60 ℃， ultrasonic extraction time is 30 min. According to the optimal process conditions， the results?showed that the sterol content of N. hybrid was as followed： the content of brassicasterol was 64.61 mg/100 g， the content of campesterol was 40.77 mg/100 g， the content of β-sitosterol was 99.04 mg/100 g， the total sterol content was 204.42 mg/100 g. The comprehensive score was not significantly different from the predictive value （P<0.05）. The results provide reference for the development and utilization of N. hybrid.

Keywords： Nymphaea hybrid; phytosterol; ultrasonic extraction technology; Box-Behnken response surface method

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.024

香水蓮花（Nymphaea hybrid）是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea）的一種多年水生宿根草本植物，香氣宜人，顏色鮮艷，觀賞價值高。20世紀70年代香水蓮花被引入我國熱帶亞熱帶地區，因其有金、黃、紫、藍、赤、茶、綠、紅和白共9種不同色系，故將其稱為九品香水蓮花[1]。香水蓮花不僅是一種觀賞植物，還具有多種藥效和保健作用[2-3]，是一種新興的藥食兩用植物，具有很高的經濟價值。香水蓮花中含有豐富的植物性胎盤素[4-5]，還含有蛋白質、多糖、多酚、黃酮、植物甾醇、生物堿等成分[6]。其中，植物甾醇具有促進膽固醇的降解代謝[7]、調節免疫[8]、抑制腫瘤[9]、抑制乳腺增生[10]、抗炎抗菌[11]等作用，在醫藥、食品、化妝品等領域都有重要應用，具有極大的藥用價值和開發價值[12]。但目前有關香水蓮花中的植物甾醇組分、含量及提取的研究報道極少。

根據本課題組的前期研究得知，香水蓮花中含有多種植物甾醇，如麥角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇等。本文以香水蓮花為研究對象，采用超聲輔助法提取香水蓮花中的甾醇，并采用Box-Benhnken響應面法優化提取工藝，旨在為香水蓮花的資源開發和高值化利用提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 香水蓮花由海南大地農旅文化投資有限公司提供;95%乙醇（分析純）、無水甲醇（分析純）、甲醇（色譜純），上海麥克林生化科技有限公司;麥角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇標準品，北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2? 儀器與設備? ALPHA2-4真空冷凍干燥機，德國Christ公司;SK2210LHC超聲波反應器，上海科導公司;N-EVAP-24氮吹儀，美國Organomation公司;LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2? 方法

1.2.1? 原料的預處理? 將新鮮的香水蓮花花瓣洗凈后置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，然后將凍干好的香水蓮花花瓣用粉碎機粉碎過60目篩，即得到香水蓮花凍干粉末，密封冷藏備用。

1.2.2? 香水蓮花甾醇的提取? 準確稱取一定量的香水蓮花凍干粉末，按一定液料比（mL/g）加入95%乙醇，置于超聲波反應器中超聲輔助提取，提取液于10000 r/min高速離心20 min，取上清液置于氮吹儀中吹干，即得到香水蓮花甾醇提取物。

1.2.3? HPLC法檢測香水蓮花甾醇含量? （1）色譜檢測條件。色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流動相為甲醇，流速0.7 mL/min，柱溫35 ℃，紫外檢測器，檢測波長210 nm，進樣量20 μL。

（2）繪制標準曲線。通過預實驗，在香水蓮花中檢測到麥角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇。分別準確稱取上述5種甾醇的標準品各25 mg，用無水甲醇配制成1.0 mg/mL的標準溶液，再稀釋為不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的標準溶液。按照色譜檢測條件進樣檢測，每個濃度標準品溶液重復檢測3次。分別以溶液濃度和峰面積作為橫、縱坐標，繪制標準曲線。

（3）混合標準品的配制及色譜檢測。分別精密稱取5種甾醇標準品各1 mg，用無水甲醇溶解并混合，定容至2 mL，按色譜檢測條件進樣檢測，得到混合標準品的色譜圖。

（4）樣品檢測。提取的香水蓮花甾醇提取物用無水甲醇溶解，定容至3 mL，準確移取1.5 mL樣品至樣品瓶中，按照色譜條件進樣檢測，每個樣品重復進樣3次。

1.2.4? 單因素實驗? 以95%乙醇為提取溶劑，在超聲功率為100 W的條件下，依次分別考察液料比（mL/g）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）、超聲提取溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、超聲提取時間（30、60、90、120、150、180 min）對香水蓮花中甾醇提取量的影響。

1.2.5? 響應面實驗? 根據Box-Behnken試驗設計原理，在1.2.4實驗結果的基礎上，以提取的菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇含量的綜合評分為響應值，設計3因素3水平實驗，對提取工藝參數進行優化，實驗因素與水平見表1。

1.3? 數據處理

采用Design Expert 8.0軟件對數據進行統計分析，并采用Origin 8.6軟件作圖。

2? 結果與分析

2.1? 香水蓮花的甾醇含量分析

2.1.1? 5種甾醇的標準曲線? 根據不同濃度甾醇標準溶液的色譜圖，計算色譜峰面積并繪制標準曲線。結果顯示，麥角甾醇標準曲線的回歸方程為y=11417858.5x?233800.3，相關系數R2=0.9996;菜籽甾醇標準曲線的回歸方程為y=7931156.5x? 135202.7，相關系數R2=0.9946;菜油甾醇標準曲線的回歸方程為y=6936456.5x?310802.5，相關系數R2=0.9935;蒲公英甾醇標準曲線的回歸方程為y= 14169061.5x?165694.7，相關系數R2=0.9906;β-谷甾醇標準曲線的回歸方程為y=5074077.0x? 50681.6，相關系數R2=0.9992。所得回歸方程的線性關系均良好。

2.1.2? 香水蓮花甾醇的定性與定量分析? 圖1和圖2分別為5種甾醇混合標準品和香水蓮花甾醇提取液（液料比30∶1 mL/g、超聲提取溫度60 ℃、超聲提取時間30 min）的HPLC色譜圖。將圖2與圖1對比，根據色譜峰的保留時間，對香水蓮花提取液中的甾醇成分進行定性分析，確定保留時間為14.39、16.17、18.51、19.94、20.78 min 的色譜峰分別為麥角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇的吸收峰。樣品中可能含有其他物質，因此保留時間與混合標準品色譜圖中的對應成分略有不同。

根據2.1.1建立的甾醇標準曲線對圖2進行定量分析，計算得到香水蓮花甾醇提取液中5種甾醇的含量，結果見圖3。由圖3可知，香水蓮花中含量較高的甾醇為菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇（均超過0.4 mg/g），因此選擇這3種甾醇提取量作為提取工藝優化的考察指標。

2.2? 單因素實驗結果

本文采用高效液相色譜法測得香水蓮花中含量較高的為菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇，以這3種甾醇提取量為評價指標，對液料比、超聲提取溫度和超聲提取時間進行單因素實驗;在此基礎上，采用Box-Behnken響應面法優化香水蓮花甾醇提取工藝并進行驗證。結果表明，影響香水蓮花甾醇提取量的主次因素是液料比>提取時間>提取溫度，其最優工藝條件為以95%乙醇為提取溶劑、超聲功率100 W、液料比30∶1（mL/g）、超聲提取溫度60 ℃、超聲提取時間30 min，預測綜合評分為2.7584;在最優工藝條件下進行驗證實驗，香水蓮花中甾醇含量為：菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/100 g，總甾醇204.42 mg/100 g，綜合評分為2.7423，與預測值相比差異不顯著。

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