青花菜BoDof5.3基因的克隆及漬水脅迫表達特征分析

裴徐梨 荊贊革 徐境 唐征 宋波

摘要：從青花菜中克隆得到一個Dof基因，命名為BoDof5.3。序列分析結果表明：該基因ORF全長774 bp，編碼257個氨基酸，編碼的蛋白質為親水性蛋白質。青花菜BoDof5.3蛋白具有典型的Zf-Dof結構域，其二級結構以無規則卷曲為主。系統進化分析結果表明，青花菜BoDof5.3蛋白與甘藍、花椰菜Dof蛋白親緣關系最近，在進化樹上聚為一組， 同屬植物的Dof蛋白具有較近的親緣關系。qRT-PCR分析結果顯示，在漬水脅迫0 d到2 d時，BoDof5.3基因表達量呈下降趨勢，6 d時表達量升高為對照的1.3倍，推測該基因可能參與青花菜漬水脅迫的響應。

關鍵詞：青花菜;Dof基因;基因克隆;漬水脅迫;表達特征

中圖分類號：S635.3文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）06-1498-05

Abstract：In this study， a Dof gene named BoDof5.3 was cloned from broccoli. Sequence analysis results showed that this gene was 774 bp in length， which encoded 257 amino acids. Furthermore， the protein encoded by this gene was a hydrophilic protein. The BoDof5.3 contained a typical Zf-Dof domain， and its main secondary structure was the random coil. Results of phylogenetic analysis indicated that the BoDof5.3 protein of broccoli had the highest homology with the Dof protein of cabbage and cauliflower， and they were clustered into a group on phylogenetic tree. Furthermore， the Dof protein in the same genus had close relationship. The results of qRT-PCR showed that the expression level of BoDof5.3 decreased from 0 d to 2 d under waterlogging stress， and the expression level at six days of waterlogging stress was 1.3 times as much as that of control. It is speculated that BoDof5.3 gene may be involved in the response of broccoli to waterlogging stress.

Key words：Brassica oleracea var. italica;Dof gene;gene clone;waterlogging stress;expression feature

Dof（DNA binding with one finger）是植物特有的一類轉錄因子，其在N-末端具有長度為52 aa的Dof結構域，可與DNA結合，同時還可進行蛋白-蛋白互作。C-末端的可變結構域可在不同的代謝途徑中產生多樣的調控功能[1-2]。目前Dof基因已在擬南芥、水稻、大豆、大麥、紅花、玉米等多種植物中成功克隆[3-8]。

前人研究發現，Dof基因廣泛參與碳氮代謝、開花、花和花粉發育、保衛細胞特異基因的調控、防御反應等多種生物學過程。在檉柳中，20個ThDof基因參與了脅迫應答。過表達ThDof16基因可明顯提高植株抗干旱和高鹽脅迫 [9]。在鹽脅迫條件下，過表達紅花CtDof1基因可增強轉基因擬南芥對鹽脅迫的抗性[7]。Hennig等在研究擬南芥Dof蛋白OBP1時發現，該蛋白可通過調控谷胱甘肽S-轉移酶6的表達來對植物激素和脅迫信號作出響應[10]。

青花菜（Brassica oleracea var.italica）與花椰菜、甘藍同屬甘藍類蔬菜，以小花蕾和嫩花莖為產品，營養豐富。其喜溫暖濕潤，但不耐澇。浙江省地處東部沿海，每年8-9月常受臺風和特大暴雨影響，青花菜育苗和定植期間易遭淹水而大面積死苗，造成嚴重經濟損失。前期試驗結果顯示BoDof5.3基因在高溫和鹽脅迫條件下表達量可發生較大變化。因此，本試驗通過克隆青花菜BoDof5.3基因，并對其特性、同源進化樹以及在漬水脅迫下的表達特征進行分析，以期為研究該基因的功能及其參與漬水脅迫的應答機制提供基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

以青花菜WN12-95為材料，種植于光照培養箱內，培養條件為25 ℃/16 h（白天）～18 ℃/8 h（晚上）。待植株長至5葉期時開始對其進行漬水脅迫處理，處理時間為0 d、2 d和6 d，每個處理設3次生物學重復。

1.2RNA的提取和cDNA的合成

葉片經液氮冷凍后迅速研磨成粉末，用于RNA的提取。總RNA提取使用TaKaRa Mini BEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒（TaKaRa公司產品），cDNA的合成采用Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（TaKaRa公司產品）。產物置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存備用。

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（責任編輯：張震林）