感冒清熱顆粒揮發油的β-環糊精包合工藝比較及穩定性研究

王艷艷 劉長河 葛文靜 李華妮

摘 要 目的：比較感冒清熱顆粒揮發油包合物的3種不同制備方法，篩選最佳的制備工藝。 方法：以揮發油包合率、包合物收得率綜合評分為指標，采用正交試驗方法對飽和溶液法、研磨法和超聲法包合揮發油的工藝進行比較。 結果：飽和溶液法包合率和收得率分別為90.0%和78.8%；研磨法包合率和收得率分別為91.1%和73.3%；超聲法包合率和收得率分別為74.3%和72.9%。 結論：研磨法制備揮發油包合物具有時間短、包合率和收得率較高的特點，優于飽和溶液法和超聲法，并且包合物具有一定的抗光照性、熱及濕穩定性。

關鍵詞 感冒清熱顆粒 揮發油 β-環糊精 包合工藝

中圖分類號：R283 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）17-0065-06

*基金項目：河南省科技攻關項目（2017zyo6o9）

Comparative study on the process of including volatile oil from Ganmaoqingre granules with β-cyclodextrin and its stability*

WANG Yanyan**， LIU Changhe***， GE Wenjing， LI Huani

（Henan Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy， Zhengzhou 450004， China）

ABSTRACT Objective： Three different methods for the preparation of volatile oil inclusion compound of Ganmaoqingre granules were compared and the best one was screened out. Methods： The processes for the volatile oil inclusion prepared by saturated solution method， grinding and ultrasonic methods were compared based on the comprehensive score of the rate of volatile oil inclusion and the yield of inclusion compound as indicators by orthogonal test method. Results： The inclusion rate and the yield were 90.0% and 78.8% for saturated solution method， 91.1% and 73.3% for grinding method and 74.3% and 72.9% for ultrasonic method， respectively. Conclusion： The grinding method for the preparation of volatile oil inclusion compound has the characteristics of short time， high inclusion rate and high yield and is superior to other ones and the prepared inclusion compound has higher capability of light- and heat- resistance and humidity stability.

KEy WORDS Ganmaoqingre granules； volatile oil； β-cyclodextrin； process

感冒清熱顆粒由陳皮、桂枝、甘草等組成，具有清熱化痰、止咳平喘等功效，臨床應用多年，療效顯著。陳皮、桂枝含揮發性成分，并與功能主治相關。陳皮來源于蕓香科植物橘（Citrus reticulate Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮。陳皮揮發油具有抑制平滑肌運動功能[1]；桂枝為樟科植物肉桂（Cinnamomum cassia Presl）的干燥嫩枝。桂枝揮發油具有抗菌、抗流感病毒作用[2]。為了避免從多味藥材中提取的揮發油在制劑制備和貯運過程中揮散損失，降低藥效，采用b-環糊精將揮發油包結起來，制成包合物加入制劑中。單味陳皮、單味桂枝及含單味陳皮、單味桂枝復方揮發油的包合多采用飽和溶液法[3-7]，也有研磨法[8-9]、超聲法[10-12]的報道。未見陳皮、桂枝混合揮發油包合研究報道。本研究采用水飽和法、研磨法、超聲法制備包合物，并比較三種方法的優劣。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪儀器廠）；DZF-6050真空干燥箱（鞏義市予華儀器有限責任公司）；紫外可見分光光度計（日本島津公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯）；揮發油測定器（鄭州玻璃儀器廠）；LRH-250-Y培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）。

感冒清熱顆粒揮發油（批號20140401）由我院制劑室提供，主要含有芳香族化合物和萜類化合物，如桂皮醛，檸檬烯等，該類化合物具有揮發性，對空氣、光、熱比較敏感，難溶于水，能完全溶解于無水乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油中；β-環糊精（批號20140906，廣東郁南糊精有限公司）；硅膠G薄層板（批號20130702，青島海洋化工有限公司）；自制蒸餾水；其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 揮發油的提取

按處方比例稱取陳皮、桂枝，加水10倍量，水蒸氣蒸餾法提取揮發油4 h，收集揮發油。結果藥材含揮發油0.7%。加大藥材量提取揮發油，備用。

1.2.2 揮發油β-環糊精包合物的制備

1）飽和溶液法 按正交表精密稱取β-環糊精，置具塞三角瓶中，加入蒸餾水100 ml，加熱至溶解，降至正交表需要溫度，恒溫攪拌；按正交試驗表各因素水平實驗，吸取揮發油溶液3 ml，加等量無水乙醇稀釋至6 ml，然后緩緩滴加入β-環糊精溶液中，分別攪拌30、60、90 min。

2）研磨法 按正交表精密稱取β-環糊精，置燒杯中，按正交試驗表需要量加入蒸餾水，加入β-環糊精，混勻，置膠體磨開始研磨，按正交試驗表吸取揮發油溶液3 ml，加等量無水乙醇稀釋至6 ml，研磨時緩緩滴加入β-環糊精溶液中，分別研磨10、20、30 min，用適量水沖洗膠體磨，沖洗液加入研磨液中；

3）超聲法 按正交表精密稱取β-環糊精，置具塞三角瓶中，按正交試驗表需要量加入蒸餾水，混勻，吸取揮發油溶液3 ml，加等量無水乙醇稀釋至6 ml，加入β-環糊精溶液中，分別超聲（350 W、50 kHz）30、45、60 min。

上述各個正交試驗樣品置冰箱中（10 ℃以下）放置 72 h，過濾，用乙醚適量洗去包合物表面黏附的揮發油，60 ℃干燥12 h，得揮發油β-環糊精包合物，稱重，計算收得率。

1.2.3 揮發油密度的測定

揮發油用無水硫酸鈉干燥（用裝有無水硫酸鈉的小柱濾過，除去水分）。精密吸取2 ml，測定重量，求得揮發油密度。揮發油密度=（油和容器重量-容器重量）÷2.0×100%=950.2 mg/ml，RSD為0.36%。

1.2.4 揮發油包合率收得率的測定

取干燥的揮發油β-環糊精包合物，加蒸餾水200 ml，照《中國藥典》2015年版[13]測定包合物中油的含量，計算揮發油包合率（%）和收得率（%）。

揮發油包合率（%）=包合物中揮發油的含量/揮發油加入量×空白回收率×100%

收得率（%）=包合物量（g）/（環糊精量+揮發油加入量×揮發油密度）×100%

1.2.5 綜合評分

揮發油包合率是評判包合效果的主要指標，包合率越高，包合效果越好，因而作為揮發油包合工藝篩選的重要指標，根據實際情況，包合率權重系數定為0.8[14]；同時收得率在大生產中對于節省原材料成本具有重要意義，在b-環糊精和揮發油投入量一定的情況下，收得率高，說明包合效果好，故揮發油包合物收得率作為次要篩選指標，權重系數定為0.2。

綜合評分=包合率×80%+收得率×20%

1.2.6 空白回收率試驗

空白回收率（%）的測定：精密吸取揮發油1.0 ml，共3份，分別置于燒瓶中，加水200 ml，照《中國藥典》2015年版測定揮發油的提出量（ml），計算空白回收率（%），本研究測得的空白回收率平均值為95%。

1.2.7 揮發油β-環糊精包合物的鑒別

1）顯微成像法 取飽和溶液法、研磨法、超聲法制備的揮發油包合物、空白包合物（按包合工藝制備），置于顯微鏡下觀察。

2）薄層色譜法 取上述按照不同工藝制備的揮發油b-環糊精包合物各0.5 g，加無水乙醇10 ml，超聲處理20 min，濾過，濾液作為供試品溶液；同法制備空白包合物供試品溶液；另取揮發油各0.1 ml，加無水乙醇10 ml使溶解，作為對照品溶液。分別吸取上述溶液各5 ml，點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-醋酸乙酯（10∶1）為展開劑，展開、取出、晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰[15-16]。

3）紫外分光光度法 取上述按照不同工藝制備的包合物及空白β-環糊精各1 g，加無水乙醇10 ml，振搖后靜置1 h，過濾，取濾液作為供試品溶液，取2.4.2項下的對照品溶液，作為對照品溶液。將上述溶液分別置紫外可見分光光度計上于200～400 nm波長范圍內掃描[17-18]。

2 結果

2.1 影響因素

飽和溶液法影響包合結果的主要因素為β-環糊精的用量和揮發油的比例、包結溫度和包結時間；研磨法的主要影響因素有β-環糊精的用量和揮發油的比例、加水量（為揮發油的倍數）和研磨時間；超聲法影響包結效果的主要因素為β-環糊精的用量和揮發油的比例、加水量（為揮發油的倍數）和超聲時間。根據預實驗結果，影響揮發油包結的因素見表1。

2.2 正交試驗結果

根據正交試驗表的各因素、水平值進行實驗，飽和溶液法、研磨法和超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%和74.3%；收得率分別為78.8%、73.3%和72.9%。飽和溶液法和研磨法的包合作用較好（表2和表3）；方差分析結果見表4。

2.2.1 飽和溶液法結果分析

1）直觀分析 根據極差大小，以包結率、收得率綜合評分為考察指標，選擇A3B2C3（表3）。

2）方差分析 由直觀分析可知，影響揮發油包合效果的因素為包結溫度>b-環糊精和油的比例>包結時間。經方差分析，b-環糊精和油的比例、包結溫度和包結時間均無顯著性影響。但b-環糊精和油的比例對包結率具有一定的影響，即：包結率隨著b-環糊精的量的增加而增大。因此選擇A3B3C3，即：環糊精與油的比例為9∶1，50 ℃，攪拌包結1.5 h。

2.2.2 研磨法結果分析

1）直觀分析 根據極差大小，選擇A3B3C1。

2）方差分析 由直觀分析可知，影響揮發油包結效果的因素為b-環糊精和油的比例>加水量>包結時間。經方差分析，b-環糊精和油的比例具極顯著影響；加水量和包結時間均無顯著性影響。但加水量具有一定的趨勢。因此選擇A3B3C1，即：環糊精與油的比例為9∶1，加水100倍（揮發油量），研磨包結10 min。

2.2.3 超聲法結果分析

1）直觀分析 根據極差大小，選擇A3B2C1。

2）方差分析 經方差分析，超聲法包結揮發油，影響揮發油包結效果的因素為b-環糊精和油的比例對包合效果有顯著性影響，加水量和包結時間均無顯著性影響。因此選擇A3B2C3，即：環糊精與油的比例為9∶1，加水200倍（揮發油量），超聲包結45 min。

2.3 驗證試驗

按照上述正交試驗結果，進行揮發油包合的驗證試驗，取三次實驗的平均值，結果飽和溶液法、研磨法、超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%、74.3%；收得率分別為78.8%、73.3%、72.9%。飽和溶液法、研磨法、超聲法的綜合評分結果分別為87.76（RSD=0.75）、87.54（RSD=1.05）、74.02（RSD=1.22），與正交試驗結果一致，表明上述揮發油包合工藝穩定、可行，可以作為感冒清熱顆粒中揮發油包合的參考。

2.4 揮發油β-環糊精包合物的鑒別

2.4.1 顯微成像法

取飽和溶液法、研磨法、超聲法制備的揮發油包合物、空白包合物（按包合工藝制備），置于顯微鏡下觀察，不同工藝的包合物為不透明塊狀，空白包合物呈規則的半透明狀。結果表明揮發油與β-環糊精確已形成了包合物（圖1）。

2.4.2 薄層色譜法

樣品溶液1、2、3和對照品溶液4在相應的位置出現了黃色斑點，且Rf值基本一致，表明揮發油包合前后化學性質沒有發生變化（圖2）。

2.4.3 紫外分光光度法

將供試品溶液和對照品溶液分別置紫外可見分光光度計上于200～400 nm波長范圍內掃描，結果揮發油在290 nm有最大吸收。而上述揮發油β-環糊精包合物及空白β-環糊精在此處無吸收峰。表明揮發油全部與β-環糊精形成了包合物（圖3）。

2.5 三種方法包合揮發油的工藝比較

飽和溶液法、研磨法、超聲法的包合率分別為90.0%、91.1%、74.3%，收得率分別為78.8%、73.3%、72.9%。飽和溶液法和研磨法的包合率和收得率均大于超聲法，所以兩種方法均適合于揮發油包合物的制備，但研磨法的制備時間較短，因此研磨法優于飽和溶液法。

2.6 揮發油包合物的穩定性研究

2.6.1 光穩定性試驗

分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發油與β-環糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于4 500 lx光照下照射10 d，分別于第0、5和10 天取樣測定，結果表明，物理混合物在第5天和第10天的揮發油相對含量下降明顯，包合物的揮發油相對含量下降較少，后者具有較好的光穩定性，在強光照射下不易分解。

2.6.2 高溫試驗

分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發油與β-環糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于60 ℃高溫下放置10 d，分別于第0、5和10天取樣測定，結果見表5。結果表明，包合物的揮發油相對含量呈下降的趨勢，但與物理混合物相比，后者的揮發油相對含量下降更為明顯，可見，揮發油包合物的熱穩定性優于物理混合物，在高溫條件下分解較緩慢。

2.6.3 高濕試驗

分別稱取適量感冒清熱顆粒揮發油包合物和按照制備投料比混勻所得的揮發油與β-環糊精的物理混合物各3份，密封于稱量瓶中，于75%高濕條件下放置10 d，分別于第0、5和10天取樣測定，結果表明，包合物受高濕條件的影響比較小，表現為揮發油的相對含量下降少，而物理混合物的揮發油相對含量明顯下降，說明了包合物在高濕條件下的穩定性高于混合物（表5）。

3 討論

本實驗采用的飽和溶液方法，首先在一定的溫度情況下環糊精形成飽和溶液后冷卻至50 ℃再滴入揮發油的乙醇溶液，使環糊精分子的中空結構與揮發油充分接觸，因此包合時間短，所選擇的溫度較低也能減少揮發油的損失，包合率和收得率高于文獻報道[3，5，10]。

對于研磨法制備包合揮發油，由于研磨過程中產生熱量容易使包合體溫度升高，從而加大揮發油易逸失的速度，因此利用膠體磨研磨包合時，利用水冷卻膠體磨，使包合體的溫度保持在較低水平，與文獻比較研磨時間較短并且具有較高的包合率[6，11]。

超聲法包合實驗時，若用飽和溶液超聲，待冷卻后容易形成環糊精結晶析出，同時溶液表面有明顯的油滴，說明沒有包結完全，因此選用常溫包結。超聲包合時間與超聲儀的功率有關，功率越大，揮發油吸收能量分散成小微粒的時間越短。超聲法包合揮發油可能是環糊精分子分散與揮發油分子之間的動態平衡過程，在這個過程中，有一部分的揮發油分子處于游離狀態，因此超聲法的包合率低于飽和溶液和研磨法。飽和溶液法和研磨法均可以用于包結本品的揮發油，可根據企業設備情況選定包結方法。超聲法的包結率較低，因此不選用。

研磨法制備揮發油包合物具有時間短、包合率和收得率較高的特點，優于飽和溶液法和超聲法。與物理混合物相比，揮發油包合物的穩定性試驗證實了其在強光、高溫、高濕條件下的穩定性均有一定程度的提高，達到了減少揮發油揮散的目的。

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