不同貯存溫度、培養基及四環素對培菲康膠囊活菌數的影響

徐愛國

摘 要 本研究探討了影響培菲康膠囊活菌數的因素：貯存溫度、培養基和四環素。結果表明：在25、30和37 ℃放置7 d，每粒膠囊所含長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌及糞腸球菌活菌數均大于1×107 CFU/g，其中，在25 ℃條件下，活菌數最多，表明菌株存活率最高；血平板中長雙歧桿菌活菌數明顯高于GAM 日本日水和GAM青島日水培養基中的活菌數，說明血平板更適宜長雙歧桿菌的生長。

關鍵詞 培菲康膠囊 貯存溫度 培養基

中圖分類號：R944.5 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）17-0071-04

Effects of different storage temperatures， media and tetracycline on the number of living bacteria in Bifico capsules

XU Aiguo*

（SPH Sine Pharmaceutical Laboratories Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT The factors affecting the number of viable bacteria in Bifico capsules were studied， including storage temperatures， media and tetracycline. The results showed that the number of live bacteria of Bifidobacterium longum， Lactobacillus acidophilus and Enterococcus faecalis in each capsule were all more than 1×107 CFU when they were incubated for 7 days at 25， 30 and 37 ℃. The number of the living bacteria and their survival rates were the highest when capsules were stored under 25 ℃. The number of B. longum was significantly higher when cultured on blood medium than the other media tested， which indicated that the blood medium was more suitable for the growth of B. longum.

KEy WORDS Bifico capsules； storage temperature； medium

培菲康膠囊（Live Combined Bifidobacterium， Lactobacillus and Enterococcus Capsules）作為一種復合微生態制劑，包含長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌三種主要益生菌，可通過補充這些益生菌促進宿主腸胃增殖新生益生菌，從而在重建宿主腸道菌群、保證腸道微生態平衡、提高機體免疫力、促進宿主健康中發揮著重要作用。它在臨床廣泛應用于兒童腹瀉、兒童功能性便秘、新生兒黃疸、腸易激綜合征等疾病的治療，對兒童厭食癥、肝硬化、幽門螺旋桿菌感染、兒童單純性腎病綜合征等也有很好的療效。

活菌數作為一種可有效考察微生態制劑有效性的質量控制指標，也是穩定性考察的重要指標。目前研究表明保藏溫度[1-4]、保藏時間[5-6]、培養基類型[5-6]、pH[2，4]及抗生素添加[4，7]是影響微生態制劑活菌數的主要因素。為了對培菲康三元復合制劑中長雙歧桿菌進行準確計數，排除嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的干擾，需要在培養基中添加四環素抑制其他兩種菌的生長，而長雙歧桿菌對四環素不敏感；盡管培菲康推薦保藏溫度為4 ℃，但考慮到患者用藥的實際情況，我們還考察25、30、37 ℃條件下短期保存的活菌數變化情況，以便準確判斷以上因素對微生態制劑活菌數的影響，為進一步優化微生態制劑的生產工藝，提高制劑中的活菌數及產品穩定性提供有效依據[8]。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

試驗菌株來自微生態制劑培菲康膠囊，是由長雙歧桿菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉、糞腸球菌菌粉按照一定比例混合而成的微生態制劑，三種單菌粉和膠囊均來自上海上藥信誼藥廠有限公司制藥總廠培菲康車間；培養基為厭氧稀釋液、MRS培養基、血平板培養基、普通營養瓊脂培養基、GAM培養基（批號20150215，青島日水生物技術有限公司；批號290409，日本日水製薬株式會社）；四環素（批號10015839，Sigma公司；批號130306-201419，中檢院標準品）。

1.2 試劑和培養基配制

1）厭氧稀釋液 胰酪胨20 g，酵母粉10 g，葡萄糖0.5 g，CaCl2 8 mg，MgSO4 8 mg，KH2PO4 40 mg，L-半胱氨酸鹽酸鹽1 g，定容至1 L，pH 7.4，115 ℃濕熱滅菌30 min；

2）MRS培養基 MRS agarose 62 g粉末溶于1 L純化水，121 ℃濕熱滅菌15 min；

3）血平板培養基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，胰酪胨3 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，大豆胨10 g，可溶性淀粉0.5 g，吐溫1 ml，豬肝浸出液170 ml，KH2PO4 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 0.4 g，FeSO4·7H2O 20 mg，NaCl 20 mg，MnSO4 13 mg，L-鹽酸半胱氨酸1 g，瓊脂17 g，用純化水定容至1 L，調節pH 7.4，115 ℃濕熱滅菌30 min；

4）普通營養瓊脂培養基 稱取營養瓊脂菌粉36 g粉末溶于1 L純化水，121 ℃濕熱滅菌15 min；

5）GAM培養基 稱取76 g溶于1 L去離子水中，115 ℃滅菌 30 min

6）四環素溶液 用去離子水配制100 mg/ml的四環素溶液10 ml，溶解搖勻，用0.22 mm的濾膜過濾滅菌后保存于4 ℃。

1.3 主要試驗設備

IMH180高端型微生物培養箱和RI-150低溫培養箱（美國賽默飛公司）；KB23低溫培養箱（德國本德爾公司）；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫療設備有限公司）；SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 不同存放溫度對活菌數的影響

將培菲康膠囊分別放置于25、30、37 ℃恒溫生化培養箱中，于存放第1、3、7天各取3粒膠囊，將其菌粉溶解于厭氧稀釋液，充分搖勻，10倍梯度稀釋后，取稀釋液100 ml涂布裝有固體培養基的3個平皿，置37 ℃培養（長雙歧桿菌于厭氧環境培養）48 h，鏡檢無雜菌，計算活菌數，并以空白組為對照。

1.4.2 不同培養基對活菌數的影響

分別取長雙歧桿菌菌粉3 g，混合菌粉5.5 g，加無菌生理鹽水27 ml，混勻。梯度稀釋至10-6、10-7，取100 ml涂布于GAM和血平板培養基，于37 ℃厭氧培養7 d，鏡檢無雜菌，計算活菌數。同法將菌液涂布于含不同來源四環素的平皿，考察其對菌落計數的影響。

1.5 統計分析

利用Excel 2019和SPSS 23數據處理軟件對試驗數據進行分析。

2 結果

2.1 溫度對菌株的影響

培菲康膠囊于25、30、37 ℃放置7 d后，每粒膠囊所含長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌活菌數均大于1×107 CFU，符合《中國生物制品規程》要求。隨著放置時間的增長，培菲康膠囊中的長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌活菌數在3種存放溫度條件下都會下降，溫度越高，活菌數下降的程度越大。相比較而言，三種菌株于25 ℃存放的存活率最高（表1）。

2.2 含或不含四環素培養基對菌粉中長雙歧桿菌活菌數的影響

結果表明，長雙歧桿菌對四環素不敏感，培養基含不含四環素對單菌粉活菌量影響不明顯；混合菌粉中長雙歧桿菌活菌數低于單菌粉計數，兩者具有顯著性差異，混合菌粉中長雙歧桿菌的存活率受嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的影響，其在添加四環素的培養基中活菌數高于不含四環素的培養基，低于單菌粉的活菌數，說明其他兩種菌在培養過程中對長雙歧桿菌有一定的抑制作用，因此后續培養基及四環素對活菌數影響的實驗采用單菌粉進行計數更為有效（表2）。

在血平板、GAM日本日水、GAM青島日水三種培養基條件下培養，未添加四環素和添加有中檢院鹽酸四環素的長雙歧桿菌活菌計數均呈現出血平板培養基中活菌數最高，與日水培養基差異明顯，GAM日本日水培養基中培養的活菌數高于GAM青島日水平培養基，但差異不明顯。表明采用血平板檢測混合菌粉中的活菌數更準確（表2）。

2.3 不同來源四環素對活菌數的影響

Sigma鹽酸四環素與中檢院鹽酸四環素（質量濃度均為100 mg/ml）對長雙歧桿菌計數的影響不同。與未添加四環素培養基中活菌數相比，添加有四環素（Sigma）的培養基中，長雙歧桿菌的活菌數數量減少了大約100倍；而在添加四環素（中檢院）的培養基中，長雙歧桿菌的活菌數數量減少了不到10倍（表3），說明了長雙歧桿菌對兩廠商四環素的敏感性存在一定的差異。

3 討論

多元復合活菌制劑中對目標菌種的計數具有較高的難度，既要抑制非目標菌種的生長又要保證目標菌種的正常生長，而在計數培養基中添加適量的抗生素是最長用的方法之一。培菲康為三元混合活菌制劑，長雙歧桿菌作為主要益生菌之一，其對不同培養基有不同的適應性。本研究中，長雙歧桿菌在血平板培養基中培養具有較高的活菌數，在進口或國產的GAM培養基中活菌數都較低，說明血平板培養基中所含的營養成分更適合長雙歧桿菌的生長。研究也表明長雙歧桿菌對不同來源四環素具有不同的耐受性，本研究中同一種培養基種添加不同品牌的四環素，長雙歧桿菌活菌數也表現出明顯差異性，其中Sigma鹽酸四環素對長雙歧桿菌活菌數具有較大影響，說明在實際運用中，應多加考慮抗生素品牌、效價及保存期等多種因素。

本研究表明影響培菲康膠囊中活菌數檢測的主要因素有貯存溫度、培養基及抗生素。考慮患者的實際情況，短途運輸或短時間非正常情況保存的條件下長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞腸球菌的活性穩定性，通過試驗說明在25 ℃條件下培菲康膠囊具有更好的穩定性，活菌維持更高。血平板培養基更適于混合菌粉中長雙歧桿菌活菌量的檢測。長雙歧桿菌對不同廠家抗生素——四環素的敏感性存在一定的差異。同濃度抗生素對活菌量影響差異的出現，是否是不同廠家抗生素存在效價差異或菌體自身抗性的不同，還有待進一步的研究。

參考文獻

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