水光譜探針及其在結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

孫 巖，蔡文生，邵學(xué)廣

(南開大學(xué) 化學(xué)學(xué)院 分析科學(xué)研究中心，天津 300071)

化學(xué)探針是指能與特定的目標(biāo)分子發(fā)生相互作用且信號可被高靈敏檢測的一類分子或材料。目前研究最為廣泛的探針類型主要有熒光和拉曼探針，其包括了金屬離子熒光探針、近紅外熒光探針、小分子成像探針及納米金屬顆粒等。由于探針的特異性、選擇性及高靈敏性，使得化學(xué)探針在分子識別、生物成像以及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域顯示出重要的應(yīng)用價值，受到化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究工作者的廣泛關(guān)注[1-3]。近年來化學(xué)探針的發(fā)展使得對化學(xué)和生物過程的理解和認知得到提升。但由于生物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，部分探針仍存在生物相容性差及細胞毒性大等問題，尋找更理想的探針仍是亟待解決的問題[4-5]。

近年來，利用水的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的特殊性建立的分析方法時有報道。如使用二次諧波顯微成像對硅材料表面的水分子進行觀測，根據(jù)水分子排列的規(guī)整程度可得到硅材料表面電荷異質(zhì)性[6]。利用水的紅外光譜作為界面相互作用的探針研究了氧化石墨烯和磷脂膜的作用機制，通過監(jiān)測氧化石墨烯誘導(dǎo)界面水的紅外譜峰變化可揭示氧化石墨烯與磷脂膜之間的相互作用，即水通過氫鍵作用連接氧化石墨烯和磷脂膜[7]。另外，以水為探針，通過紅外光譜結(jié)合電化學(xué)分析研究電場擾動對帶電磷脂膜/溶液界面的影響，發(fā)現(xiàn)受限于磷脂極性頭部的強氫鍵水可在一定范圍內(nèi)抵抗外部電位的干擾，并且這部分水會極大地影響磷脂膜的靜電性質(zhì)[8]。

近紅外光譜不僅可體現(xiàn)含氫基團的結(jié)構(gòu)信息，還體現(xiàn)了包括氫鍵在內(nèi)的分子內(nèi)和分子間相互作用信息，可用于研究水溶液體系或含水量較多的樣品。當(dāng)溫度發(fā)生改變時，分子相互作用也會發(fā)生變化，進而引起近紅外光譜的變化。基于近紅外光譜的溫度效應(yīng)，發(fā)展了溫控近紅外光譜技術(shù)。由于水的結(jié)構(gòu)特點，其近紅外光譜很容易受到溫度的影響，當(dāng)溫度發(fā)生改變時，從隨溫度變化的光譜中可獲取水與溶質(zhì)之間的相互作用信息。Gowen等[9]使用多元曲線分辨-交替最小二乘的方法從無機鹽(NaCl、KCl、MgCl2和AlCl3)水溶液的溫控近紅外光譜中提取與水結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征光譜信息，分析了水的特征光譜隨溫度和離子濃度的變化，結(jié)果表明KCl和NaCl傾向于破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，而MgCl2和AlCl3傾向于促進水分子之間的氫鍵形成。Tsenkova提出了“水光譜組學(xué)(Aquaphotomics)”，并開展了一系列研究工作[10]。結(jié)果表明，利用水的近紅外光譜隨擾動條件的變動不僅可作為“鏡子”反映溶質(zhì)的動力學(xué)過程以及外部條件對溶液產(chǎn)生的影響，還可對疾病或異常狀態(tài)進行無損診斷。如利用隨溫度變化的水特征光譜研究不同金屬離子導(dǎo)致朊病毒蛋白纖維化的過程機理[11]，利用水結(jié)構(gòu)變化監(jiān)測胰島素纖維的成核過程[12]，利用水化層中水結(jié)構(gòu)的信息實現(xiàn)對大豆花葉病潛伏期的診斷[13]，以及通過檢測大熊貓尿液中水的光譜判斷大熊貓是否處于發(fā)情期[14]等。上述研究表明，利用水為探針，通過變化的水光譜，可以反映出擾動的影響以及水與溶質(zhì)之間的相互作用。

本課題組將水作為探針，利用溫控近紅外光譜技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)算法，從隨溫度變化的光譜中提取光譜信息和解析信號，開展了水溶液體系的近紅外光譜分析研究。如建立了新型化學(xué)計量學(xué)方法，并從溫控近紅外光譜信號中提取物質(zhì)的特征光譜信息，通過特征光譜隨溫度的變化對溶液中的相互作用進行了分析[15-20]；將體系中水的光譜信息及其受溫度的影響用于蛋白質(zhì)和聚合物的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變研究，揭示了化學(xué)結(jié)構(gòu)變化過程中水的作用及作用機理[21-25]；探索了溫控近紅外光譜技術(shù)在生命分析和疾病診斷中的應(yīng)用[26-27]。

1 溫控近紅外光譜技術(shù)

溫控近紅外光譜技術(shù)是從隨溫度變化的近紅外光譜中提取與溫度相關(guān)的信息，用于研究水溶液體系和生物體系中溶質(zhì)結(jié)構(gòu)變化及其相互作用。為了得到隨溫度變化的近紅外光譜，采集了每個樣品在不同溫度下的近紅外光譜，得到一個具有波數(shù)和溫度的二維矩陣。當(dāng)加入其他擾動時，如濃度、pH值等，每一組樣品得到的是包括波數(shù)、溫度及濃度(或pH)的三維矩陣，甚至是四維矩陣。在本課題組的研究中，近紅外光譜均由Vertex 70多波段近紅外光譜儀(Bruker公司，德國)測量，使用InGaAs檢測器和鹵族鎢燈光源。溫度由2216e型溫度控制器(Bruker公司，德國)控制，溫度控制精度為±0.1 ℃。

為了從光譜中提取不同溫度下與水結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息，采用化學(xué)計量學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行處理分析。利用這些數(shù)據(jù)集，采用互因子分析(MFA)、獨立成分分析(ICA)以及包括高維主成分分析(NPCA)、平行因子分析(PARAFAC)和交替三線性分解(ATLD)的高階分解方法來提取水隨溫度變化的光譜信息。使用高斯擬合獲得重疊光譜中組分的光譜分量。此外，還利用連續(xù)小波變化(CWT)消除背景漂移和提高光譜分辨率，以及采用二維相關(guān)光譜分析研究溫度引起光譜變化的順序。

2 結(jié)構(gòu)信息的提取

由于水溶液的近紅外光譜吸收峰重疊嚴(yán)重，而且溶液中溶質(zhì)相互作用引起的光譜變化會增加光譜的復(fù)雜性，很難從原始光譜中直接得到物質(zhì)的特征信息。通常需要提高光譜分辨率或?qū)庾V進行解析以提取純組分的特征光譜信息，并通過特征光譜隨溫度的變化情況對溶液中的相互作用進行分析。為了提高光譜分辨率，采用CWT的高階導(dǎo)數(shù)方法對水-乙醇混合物的近紅外光譜進行分析，從四階和六階導(dǎo)數(shù)光譜中得到了水和乙醇形成團簇的信息以及OH和CH基團間的相互作用信息，證明了光譜的復(fù)雜性。然后利用純水和乙醇的光譜擬合混合物的導(dǎo)數(shù)光譜，得到了乙醇系數(shù)與其含量呈線性關(guān)系，而水的系數(shù)及其含量呈非線性關(guān)系，這表明混合物中乙醇對水結(jié)構(gòu)的影響，說明水可作為分析水和乙醇相互作用的探針[15]。為了進一步提取溶液中純組分的光譜特征，提出一種基于主成分分析(PCA)載荷旋轉(zhuǎn)的方法，通過計算得到混合物體系中各組分的光譜信息。利用所建立的方法對水-乙醇混合體系的溫控近紅外光譜進行分析，得到了混合溶液中水和乙醇的光譜信息，再利用計算光譜和純物質(zhì)光譜的差異，得到水和乙醇在溶液中的結(jié)構(gòu)信息以及二者之間的相互作用信息，并觀察到乙醇使水的結(jié)構(gòu)更加有序化。有趣的是，以上結(jié)果均得到了7個與水相關(guān)的吸收峰，表明這7個吸收峰可能是與溫度變化緊密相關(guān)的水特征光譜。

為了更好地提取受溫度影響的水結(jié)構(gòu)信息，提出了一種從溫控近紅外光譜中選取與溫度相關(guān)變量的方法[17]。結(jié)合CWT和蒙特卡洛無信息變量消除(MC-UVE)，首先將光譜分解為不同頻率的光譜成分，再利用MC-UVE評估變量與溫度的相關(guān)性，通過模擬數(shù)據(jù)驗證了該方法的可行性，并通過不同水溶液的溫控近紅外光譜驗證了該方法的適用性。進一步對水的溫控近紅外光譜進行分析，提取了水光譜中與溫度相關(guān)的7個變量，證實了水中存在7個與溫度變化緊密相關(guān)的波長。將該方法用于不同溶液的溫控近紅外光譜分析，發(fā)現(xiàn)所選的7個變量在不同溶液中的波數(shù)相近但不完全相同，且與溶質(zhì)濃度相關(guān)，說明水光譜可以作為反映水溶液差異的探針[17]。以上結(jié)果說明,從溫控近紅外光譜中提取的隨溫度變化的水光譜信息可作為探針分析溶液中的結(jié)構(gòu)變化與相互作用。

3 分子間相互作用分析

將水作為探針，通過提取隨溫度變化的水光譜信息，對小分子溶質(zhì)(醇、葡萄糖、寡肽等)進行了結(jié)構(gòu)與相互作用分析。首先研究了小分子醇與水的相互作用，使用高維算法(NPCA、PARAFAC、ATLD)從水-乙醇混合物溶液的溫控近紅外光譜中提取信息，并研究了溫度和濃度對水-醇混合物結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，通過NPCA分解得到的光譜信息包含了水、乙醇、水-乙醇團簇的混合信息，解釋了數(shù)據(jù)絕大部分的方差；通過PARAFAC和ATLD分解得到的載荷反映了單個組分的光譜信息，包括乙醇和不同結(jié)構(gòu)的水團簇的光譜信息[18]。

為了研究葡萄糖與水的相互作用，分析了不同溫度下葡萄糖水溶液的近紅外光譜。通過CWT提高光譜的分辨率，識別出溶液中存在的含有不同氫鍵的水結(jié)構(gòu)光譜特征。根據(jù)光譜特征的位置，使用高斯擬合方法對水吸收峰進行分析，獲得與水結(jié)構(gòu)相關(guān)的6個光譜特征，分別為水分子的轉(zhuǎn)動峰以及含有0、1、2、3、4個氫鍵的水結(jié)構(gòu)，表示為Sr、S0、S1、S2、S3及S4。通過不同水結(jié)構(gòu)含量隨著溫度以及葡萄糖濃度的變化，發(fā)現(xiàn)水結(jié)構(gòu)氫鍵的斷裂以及葡萄糖可使水的有序結(jié)構(gòu)增強，從而為解釋糖類化合物在生物體系中的“保護作用”提供了新的依據(jù)[19]。作為蛋白質(zhì)片段，寡肽可在一定程度上反映蛋白質(zhì)的性能。為了研究寡肽與水的相互作用，采集了不同濃度的天冬氨酸五聚體(D5)和賴氨酸五聚體(K5)在不同溫度下的近紅外光譜。利用ICA分別對兩組溶液的溫控近紅外光譜進行分析，以提取光譜中隨溫度具有獨立變化規(guī)律的溶質(zhì)和水的光譜信息。從4 700～4 300 cm-1波段的獨立成分中得到了NH和CH2的光譜信息，發(fā)現(xiàn)K5和水之間的相互作用強于D5。從8 000～6 000 cm-1波段的光譜中得到3個獨立成分，包含了不同水結(jié)構(gòu)(S0、S1和S2)的光譜信息。通過分析這些水結(jié)構(gòu)的光譜強度隨溫度的變化，發(fā)現(xiàn)寡肽的加入使水的熱穩(wěn)定性增強，賴氨酸五聚體水溶液中疏水水合占主導(dǎo)地位，水分子在氨基酸殘基的烷基側(cè)鏈周圍形成“水籠”；而在天冬氨酸五聚體水溶液中親水水合為主要作用，水分子通過一個氫鍵與寡肽分子相結(jié)合[20]。

4 蛋白質(zhì)與溫敏聚合物的結(jié)構(gòu)變化

大分子與簡單小分子相比，由于官能團眾多，與水之間相互作用的形式更加多樣。親水基團與水的吸引作用以及疏水基團與水的排斥作用之間形成的平衡使得大分子能夠穩(wěn)定存在于溶劑水中，而溫度會改變蛋白質(zhì)、聚合物等大分子中含氫基團之間以及大分子與水之間的氫鍵作用，從而使得大分子的水溶液發(fā)生相分離的現(xiàn)象，利用溫控近紅外光譜技術(shù)可幫助理解大分子的結(jié)構(gòu)變化以及相變機理。

對不同溫度下血清蛋白水溶液的近紅外光譜進行分析，采用CWT提高近紅外光譜的分辨率，通過對蛋白質(zhì)特征光譜的分析得到了蛋白質(zhì)的變性溫度，然后對不同溫度下水的光譜區(qū)域進行分析，發(fā)現(xiàn)水結(jié)構(gòu)在達到蛋白質(zhì)的變性溫度時發(fā)生明顯變化，說明通過水結(jié)構(gòu)的變化可以間接反映蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化[21]。為了進一步研究水在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化中的作用，采用CWT結(jié)合MC-UVE篩選出與血清蛋白質(zhì)特征吸收相關(guān)的變量。通過對不同水結(jié)構(gòu)對應(yīng)吸收峰的峰強度隨溫度的變化進行分析，發(fā)現(xiàn)含有3個氫鍵的水結(jié)構(gòu)變化與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的轉(zhuǎn)折點一致，進一步證明了水可以作為研究生物體系中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的探針[22]。

為了分析水在球狀卵清蛋白(OVA)凝膠化過程中的作用，采集了不同濃度OVA水溶液的溫控近紅外光譜。使用CWT提高近紅外光譜的分辨率，并從小波變換后的光譜中得到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化信息。通過分析蛋白質(zhì)特征峰峰強度隨溫度的變化，確認了卵清蛋白凝膠化過程經(jīng)歷3個階段，即：階段I(天然態(tài))、階段Ⅱ(熔球態(tài))和階段Ⅲ(凝膠態(tài))。通過二維相關(guān)光譜和高斯擬合分析了凝膠化過程中含有不同氫鍵的水結(jié)構(gòu)(S0～S4)及其含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)含兩個氫鍵的水結(jié)構(gòu)(S2)與卵清蛋白的結(jié)構(gòu)變化密切相關(guān)，也呈現(xiàn)三階段變化，且轉(zhuǎn)折點與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化轉(zhuǎn)折點一致。在OVA的凝膠化過程中S2含量不斷減少，在前兩個階段，該變化發(fā)生在其他水結(jié)構(gòu)變化之后，但在階段Ⅲ，該變化發(fā)生在自由水變化之前。結(jié)果揭示了在天然態(tài)和熔球態(tài)時，S2位于水化層中維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，而在凝膠態(tài)時，高溫使得S2的氫鍵減弱，導(dǎo)致水化層被破壞，進而使卵清蛋白團簇之間相互聚集形成凝膠結(jié)構(gòu)。此研究闡明了S2對蛋白質(zhì)水凝膠形成過程的重要性，也證明了水可以作為探針來反映蛋白質(zhì)凝膠化過程中的結(jié)構(gòu)變化[23]。

為了分析尿素誘導(dǎo)tau蛋白聚集過程中水合水的氫鍵結(jié)構(gòu)變化，以tau蛋白聚集的核心片段R2/wt為研究對象，測量了37 ℃下水溶液中R2/wt聚集過程的近紅外光譜[24]。為了提高光譜分辨率，使用CWT進行變換處理，從高分辨率的光譜圖中觀察到蛋白質(zhì)特征結(jié)構(gòu)(β-折疊)的變化主要分為兩個階段。為了分析水結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)聚集過程中的變化，使用主成分分析提取了水合水的光譜特征，從載荷圖中得到水合水主要是由形成一個或兩個氫鍵的水結(jié)構(gòu)組成，在R2/wt親水基團周圍，水和NH基團以一個氫鍵的形式相連，而在疏水側(cè)鏈周圍，水分子之間以兩個氫鍵的形式相連。從得分圖中得到了水合水隨時間的變化趨勢與β-折疊結(jié)構(gòu)相反，但擁有相同的轉(zhuǎn)折點和階段性。這個結(jié)果說明在R2/wt相互聚集的初期，R2/wt周圍的水合水迅速離開并進入溶劑水中。當(dāng)形成分子間β-折疊結(jié)構(gòu)時，水合水的排出變得緩慢。為了得到含不同氫鍵的水結(jié)構(gòu)在聚集過程中變化的先后順序，使用二維相關(guān)光譜進行了分析。從同步譜和異步譜中得到形成一個氫鍵的水分子先于自由的OH和形成兩個氫鍵的水分子變化。此結(jié)果說明，在R2/wt聚集的初級階段，水合水與NH基團形成的氫鍵先斷裂，導(dǎo)致水合水的氫鍵網(wǎng)絡(luò)發(fā)生變化。然后，疏水側(cè)鏈周圍的水的氫鍵網(wǎng)絡(luò)被破壞，使得聚集物進一步形成有序的纖維狀結(jié)構(gòu)。上述研究進一步證明從近紅外光譜中提取的水合水信息可以作為探針來反映蛋白質(zhì)纖維化的過程[24]。

另外，對于具有最低臨界溶解溫度(LCST)的高分子聚合物與水的相互作用也進行了分析[25]。采集了不同濃度的聚甲基丙烯酸N,N二甲氨基乙酯(PDMAEMA)水溶液的溫控近紅外光譜。為了提高光譜分辨率，采用CWT進行處理。通過分析聚合物的特征峰強度隨溫度的變化可看出，在高濃度和低濃度水溶液中聚合物鏈傾向于在36 ℃以下形成松散結(jié)構(gòu)，并分別在約38 ℃或39 ℃發(fā)生LCST行為聚集成膠束。高濃度和低濃度水溶液的LCST溫度不同，說明具有不同的相轉(zhuǎn)變機理。為了研究不同濃度聚合物的相轉(zhuǎn)變機理以及水在其中的作用，采用NPCA對CH和OH波段分別進行分析。從載荷圖中得到了包含CH基團以及不同水結(jié)構(gòu)的信息。根據(jù)分析CH波段得到的得分隨溫度的變化，發(fā)現(xiàn)低濃度溶液在36 ℃以下時，其高分子鏈發(fā)生去水合，形成松散的中間態(tài)結(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，松散結(jié)構(gòu)被破壞而形成膠束。而高濃度溶液中無中間態(tài)的疏水結(jié)構(gòu)，隨著溫度的升高，其高分子鏈逐漸去水合形成膠束。通過分析不同水結(jié)構(gòu)的溫度得分發(fā)現(xiàn)，在低濃度溶液中，隨著溫度的升高，含有兩個氫鍵的水結(jié)構(gòu)(S2)在36 ℃之前逐漸增加，但在該溫度之后含量突然減少，這表明S2在松散結(jié)構(gòu)的形成中起重要作用，即通過S2在松散結(jié)構(gòu)中起到橋連作用。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，氫鍵的解離使得中間體被破壞形成膠束結(jié)構(gòu)。然而，對于高濃度溶液，未發(fā)現(xiàn)S2的光譜信息，表明高分子鏈直接脫水形成膠束。上述結(jié)果表明通過水結(jié)構(gòu)的變化可以反映高分子材料的相轉(zhuǎn)變機理，該方法也為研究溫敏性高分子材料的相轉(zhuǎn)變機理提供了一種有力手段[25]。

5 健康與疾病診斷

基于水可以反映溶質(zhì)變化的理論，將水作為探針，使用溫控近紅外光譜技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法挖掘與血清樣品差異相關(guān)的水結(jié)構(gòu)信息，以達到利用血清樣品進行疾病診斷的目的。如采用離散小波變換(DWT)和變量篩選方法分析了健康人和疑似腎病患者的血清的近紅外光譜，并提取了和水有關(guān)的信息，利用PCA、線性判別分析(LDA)和偏最小二乘判別分析(PLSDA)進行疾病的判別，得到了較好的結(jié)果[26]。

使用化學(xué)計量學(xué)計算并分析了對照組(健康人)和病患組(Ⅱ型糖尿病患者和冠心病患者)的血清光譜[27]。采用二維相關(guān)光譜提取了非氫鍵(NHB)、弱氫鍵(WHB)和強氫鍵(SHB)水結(jié)構(gòu)的信息。利用這些水結(jié)構(gòu)因溶質(zhì)不同而引發(fā)的差異，正確識別了對照組和病患組。此外，還利用SHB和WHB水結(jié)構(gòu)之間的相關(guān)性，成功診斷了糖尿病和心臟病。利用化學(xué)計量學(xué)方法提取近紅外光譜中的水結(jié)構(gòu)信息為疾病的快速診斷提供了一種有效的分析手段。目前，該技術(shù)在疾病診斷方面的應(yīng)用研究較少，還需要研究者共同探索和努力。

6 結(jié) 論

化學(xué)探針在分子識別、生物成像以及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域具有重要價值。水作為一種新型探針可用于研究水溶液體系或生物體系中水與溶質(zhì)的相互作用。將水作為探針，利用水的結(jié)構(gòu)對溫度敏感的特點，結(jié)合溫控近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計量學(xué)方法，通過提取隨溫度變化的水光譜信息對不同物質(zhì)進行結(jié)構(gòu)分析以及相互作用分析，為近紅外光譜在生物和生命體系分析中的應(yīng)用提供了新的研究思路。溫控近紅外光譜技術(shù)和化學(xué)計量學(xué)方法為近紅外光譜在水溶液和實際復(fù)雜體系分析中的應(yīng)用提供了技術(shù)手段。隨著科研工作的不斷深入，越來越多的水光譜特征得到挖掘，成為探索和理解水在化學(xué)和生物過程中作用與功能的重要信息來源。