清火抗毒丸的薄層色譜鑒別研究

趙 穎 李海歐 張旭東 顧艷麗* 楊彩靜謝宇鑫 金兆宇（.內蒙古醫科大學 呼和浩特 000；.巴彥淖爾市殘聯眼科醫院 巴彥淖爾 05000）

清火抗毒丸是由黃芩、梔子、連翹、金銀花等幾味藥組成，具有清熱解毒、瀉火、降壓、抗炎等功效，適用于細菌性、病毒性結膜炎、角膜炎、瞼板腺感染及化膿性淚腺炎等眼瞼及眼眶炎癥疾病的治療。為提高藥品的質量控制要求，采用薄層色譜法鑒別清火抗毒丸中的梔子、黃芩，該方法操作簡便，快捷，結果可靠，為其他制劑中梔子、黃芩的鑒別提供依據。

1 儀器與試藥

真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-4水浴鍋（常州榮華儀器制造有限公司）；SB25-12DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）；梔子對照藥材（中國食品藥品檢定研究院），批號：120986-201610；梔子苷（中國食品藥品檢定研究院），批號：110749-201718；黃芩苷（中國食品藥品檢定研究院），批號：110513-201711；清火抗毒丸（巴彥淖爾市殘聯眼科醫院提供，批號 20180720，20180722，20180724），所用藥材購自天津中藥飲片廠，經內蒙古醫科大學教授渠弼鑒定；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、甲酸、硫酸、乙醚、三氯甲烷、冰醋酸、甲苯、鹽酸等均為分析純。

2 方法和結果

2.1 黃芩薄層色譜鑒別：取本品粉末2g，加入乙醚溶液30mL，通過超聲處理30min后，濾過，棄去乙醚溶液，揮干藥渣中乙醚溶劑，加入甲醇30mL，再次超聲處理30min，將其濾過，把濾液蒸干，將20mL水加入殘渣使殘渣溶解，用鹽酸試劑調節溶液pH值至1～2，用乙酸乙酯溶液振搖提取2次，每次20mL，將兩次的乙酸乙酯液體合并，并蒸干，最后加入3mL的甲醇溶液使殘渣溶解。按照同樣的方法和處方比例制備缺少黃芩的陰性對照溶液。再稱取適量的黃芩苷對照品，加入甲醇制成每1mL甲醇中含1mg黃芩苷對照品的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，將上面所說的兩種溶液各吸取0.5μL，分別點在同一聚酰胺薄膜上面，用甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1.2）作為展開劑，將展開劑放入展開缸中預飽和30min，然后展開，小心取出，將薄層板晾干，用2%的三氯化鐵乙醇溶液噴到薄層板上。比較供試品色譜與對照品色譜中斑點的位置和顏色，二者斑點均相同，且在陰性對照的色譜中與對照品色譜相同的位置上沒有干擾，見圖1-A。

2.2 梔子薄層色譜法鑒別：稱取本品2g，研細后，加入乙醚溶液10mL，通過超聲處理20min后，棄去乙醚溶液，藥渣揮干，加入乙酸乙酯溶液20mL，經過加熱回流1h，取出，然后放冷，將其濾過，并將濾液蒸干，加入2mL的甲醇溶液使殘渣溶解，濾過，濾液為供試品溶液。處方中除去梔子，根據處方比例按照上述方法制成陰性對照溶液。另外稱取0.5g的梔子對照藥材，按照相同的方法配制成對照品藥材溶液。再稱取梔子苷的對照品，加入乙醇制成每1mL乙醇中含4mg的對照品溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法（通則0502）進行試驗，精密吸取以上四種溶液，用同一硅膠G薄層板，點樣量皆為2μL，以三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（10∶4∶1∶1）為展開劑，在展開缸中展開后，小心取出，晾干后，在薄層板上噴10%的硫酸乙醇溶液，在105℃的條件下加熱到薄層板上斑點顯色清晰。比較供試品與對照品的色譜，發現斑點的位置及顏色都相同，陰性對照無干擾，見圖1-B。

3 討論

3.1 黃芩的鑒別

3.1.1 提取溶劑及方法比較：取效果，黃芩的主要成分為黃芩苷，方法一經乙醇超聲提取、方法二先經乙醚萃取，棄去乙醚液，以除去干擾成分，再用甲醇超聲處理本品，提取黃芩苷，酸化后以乙酸乙酯萃取。結果表明后者薄層色譜中斑點清晰，陰性對照無干擾。

3.1.2 薄層板比較：根據藥典方法，比較了展開劑在硅膠G薄層板和聚酰胺薄膜上的展開效果，聚酰胺薄膜具有較好的親水和親脂雙重性能，適用于黃酮類成分的中藥分離，黃芩苷屬于黃酮類化合物[1]，在聚酰胺薄膜上展開，斑點清晰，陰性無干擾，因此選擇聚酰胺薄膜展開。

3.1.3 展開劑比較：此次考察以下展開條件，甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2）（Ⅰ）[2]，甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1）（Ⅱ）[3]，甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1.2）（Ⅲ），與藥典展開系統（Ⅰ）比較，（Ⅰ）展開后斑點較集中，極性較小，使各成分不能分開，（Ⅱ）展開后，斑點清晰但有少許拖尾現象，（Ⅲ）展開后斑點圓整且清晰，陰性對照沒有干擾，在同一種展開系統中，極性愈大，對化合物的洗脫能力越大，即在薄層板上把主要斑點推得越遠，Rf值也越大。藥典中的展開劑極性較小，在實驗中發現丙酮的極性較乙酸乙酯大，冰醋酸的極性較甲酸大，所以換用極性較大的展開系統（Ⅲ）進行層析，發現在跑板中Rf值適中，不拖尾，所以選用展開系統（Ⅲ），用冰醋酸替換甲酸，丙酮替換乙酸乙酯。綜上，實驗篩選出的理想展開系統為甲苯-丙酮-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1∶1.2）。實驗同時對展開環境的溫度和相對濕度進行了考察，結果溫度在18℃～25℃，相對濕度在25%～50%，薄層色譜中斑點的分離度較好。展開系統確定后進行了穩定性實驗和重復性實驗，穩定性實驗的結果說明供試品以及對照品溶液在6h進行薄層色譜鑒別，色譜中主要斑點的分離度很好。重復性實驗結果表明，展開系統展開的重復性方法良好。中藥分析中，三氯化鐵的乙醇溶液廣泛應用于黃酮類成分定性、定量分析的顯色劑，能與黃芩苷成分顯綠色，因此，可用于實驗中黃芩的薄層層析鑒別。

3.2 梔子的鑒別

3.2.1 提取溶劑及方法比較：比較了三種溶劑提取的效果，50%甲醇超聲提取、乙醚除雜后水飽和的正丁醇提取、經乙醚萃取，棄去乙醚液，除去干擾成分，再用乙酸乙酯回流提取。結果表明后者薄層色譜中斑點圓整清晰，雜質斑點更少，無拖尾現象，Rf值適中，選擇該方法提取。

3.2.2 展開劑選擇：實驗中考察了以下展開系統，乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（10∶7∶2∶0.5）（Ⅰ）[4]，乙酸乙酯–丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）（Ⅱ）[5]，正丁醇-三氯甲烷-甲醇-水（4∶4∶1∶0.2）（Ⅲ）[6]，三氯甲烷-甲醇-冰醋酸-水（10∶4∶1∶1）（Ⅳ）[7]。展開劑（Ⅰ）和（Ⅱ）展開后，斑點不清晰，而且陰性有干擾。（Ⅲ）展開后有清晰的斑點，但是背景顏色較深，選擇（Ⅳ）展開，斑點較圓且清晰，陰性對照無干擾。因此選擇展開劑（Ⅳ）。實驗條件確定后進行了耐用性考察，考察了點樣量、展開距離、預飽和時間、顯色溫度對實驗的影響，結果表明，點樣量為1μL，展開距離為6cm，預飽和時間為20min，顯色溫度為105℃時，斑點顯色清晰，分離度好。采用10%硫酸乙醇溶液顯色，顯色后在日光下觀察發現顯色靈敏，雜質斑點較少，主斑點清晰，較為規則，分離度及重現性較好。在紫外燈（365nm）下檢視，發現陰性對照中的雜質熒光有干擾，因此，選擇在日光下檢視。

4 結論

清火抗毒丸含有藥材較多，成分十分復雜，在本實驗中，通過有效的前處理，除去干擾雜質，使薄層色譜分離效果好，并且設置陰性對照，用三批樣品實驗確證，該方法專屬性強，梔子、黃芩中有效成分斑點清晰，易于判斷，重現性好，能反映該制劑的質量，可用于該制劑的質量控制。