液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)及其加工品中孔雀石綠

于 宙，谷小鳳，丁白瑜

（1.青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究所，山東青島 266061；2.青島市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東青島 266061）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）既是染料，也是殺真菌、細(xì)菌、寄生蟲的藥物，可用作治理魚類或魚卵的寄生蟲、真菌或細(xì)菌感染，但長期超量使用有潛在的致癌、致畸、致突變的作用[1]?？兹甘G進(jìn)入水生動物體內(nèi)后，會快速代謝成脂溶性的無色（隱色）孔雀石綠（Leucomalachite Green，LMG）[2]。無公害水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域國家明令禁止添加，在養(yǎng)殖業(yè)中的使用未得到美國食品與藥物管理局（FDA）的認(rèn)可；根據(jù)歐盟法案2002/675/EC[3]的規(guī)定，動物源性食品中孔雀石綠和無色孔雀石綠殘留總量限制2 μg/kg；日本的“食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度（Positive List System）”規(guī)定在進(jìn)口水產(chǎn)品中不得檢出孔雀石綠殘留；我國在農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY 5071—2002無公害食品魚藥使用準(zhǔn)則》中也將孔雀石綠列為不得使用的禁用藥物。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的《食用動物禁用的獸藥及其他化合物清單》中規(guī)定孔雀石綠原料藥及其單方、復(fù)方制劑產(chǎn)品于2002年4月15日一律停止使用。由于沒有價格低廉有效的替代品，孔雀石綠在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的使用屢禁不止。使用了含有MG與LMG原料的加工水產(chǎn)品如魚片、干海參等也會含有殘留物。每年由于孔雀石綠藥物殘留造成的退貨和銷毀事件，給企業(yè)造成巨大損失[4]。

水產(chǎn)及其加工品中含有較多脂肪等雜質(zhì)，特別是水產(chǎn)加工品經(jīng)過預(yù)處理、調(diào)味、干燥、烘烤等步驟，引入了食鹽、味精、淀粉等調(diào)味料，基質(zhì)更加復(fù)雜，凈化提取困難，干擾MG、LMG的測定?，F(xiàn)有測定方法有液相色譜法[5-8]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-18]、酶聯(lián)免疫法[19]、電化學(xué)法[20-21]和離子阱質(zhì)譜[22]等，其中應(yīng)用最為廣泛的是液相色譜法與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法采用溶劑提取、液液萃取和固相萃取柱凈化，將MG用硼氫化鉀還原為代謝產(chǎn)物L(fēng)MG用熒光檢測器檢測；或以二氧化鉛柱后衍生將LMG氧化為MG，以紫外或二極管陣列檢測器測定總量。相比液相色譜法，LC-MS/MS具有專屬性好、干擾少、靈敏度高和避免假陽性等優(yōu)點(diǎn)，在定性與定量檢測中表現(xiàn)良好，是簡便快速的測定方法。

目前LC-MS/MS測定MG、LMG時存在以下缺點(diǎn)：一是液液萃取難分層；二是萃取液濃縮時目標(biāo)化合物損失嚴(yán)重；三是陽離子交換柱凈化時洗脫效果不佳，回收率較低。針對以上問題，試驗(yàn)改善了前處理方法，省去液液萃取、選擇中性氧化鋁粉分散固相萃取、優(yōu)化陽離子交換柱淋洗及洗脫液[13，22]，顯著降低目標(biāo)物損失。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

乙腈、甲醇、甲酸，色譜純，Honeywell霍尼韋爾公司提供；氨水、無水乙酸銨，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；超純水（18.2MΩ），ELGA超純水機(jī)，威立雅水處理技術(shù)有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、同位素內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠（D5-MG）、氘代隱色孔雀石綠（D6-LMG），德國Dr.Ehrenstorfer公司提供。

5 mmol/L乙酸銨：稱取0.385 0 g無水乙酸銨溶于1 000 mL水中，以冰乙酸調(diào)pH值到4.5，過0.2 μm濾膜；酸化乙腈：冰乙酸+乙腈=2+98；甲酸溶液：加酸+水=2+98；氨水甲醇：氨水+甲醇=5+95。

Waters Xevo TQ-S液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，沃特世公司提供。

XHF型均質(zhì)器，寧波新芝生物科技有限公司產(chǎn)品；3-30K型離心機(jī)，德國SIGMA公司產(chǎn)品；DC型氮吹儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司產(chǎn)品；VOKTEX型渦旋混勻器，海門市貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；12位SPE型固相萃取裝置，德國CNW公司產(chǎn)品。

MCX陽離子交換柱：60 mg/3 mL，使用前依次以乙腈3 mL和2%甲酸溶液3 mL活化。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工作曲線

稱取適量MG，LMG，D5-MG，D6-LMG，以乙腈溶解配制成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液和內(nèi)標(biāo)儲備液，臨用前以乙腈稀釋為100 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液。分別吸取一定量標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液，以5 mmol/L乙酸銨+乙腈=1+1稀釋為MG，LMG質(zhì)量濃度為 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 ng/mL的工作液，該工作液中D5-MG，D6-LMG質(zhì)量濃度均為2.0 ng/mL。

1.2.2 前處理方法

準(zhǔn)確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，添加100 μL內(nèi)標(biāo)中間液，加入12 mL酸化乙腈，均質(zhì)30 s，另取10 mL酸化乙腈清洗均質(zhì)刀頭，超聲提取3 min，離心后轉(zhuǎn)移上清液，將清洗刀頭的清洗液移入離心沉淀，渦旋分散殘渣，超聲提取5 min，離心后合并2次上清液。加入2g中性氧化鋁粉，渦旋混勻并靜置，過濾掉氧化鋁粉。鮮活水產(chǎn)品定容至25 mL，取5 mL以初始流動相定容至1 mL，過膜待測；水產(chǎn)加工品通過陽離子交換柱，以5 mL酸化乙腈淋洗，棄去流出液，5 mL氨水甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，以初始流動相定容至5 mL，過膜待測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC C18色譜柱，1.7 μm，2.1×50 mm；進(jìn)樣量 10 μL，柱溫 30 ℃，流動相為5 mmol/L乙酸銨與乙腈。

梯度程序見表1。

表1 梯度程序

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測掃描，毛細(xì)管電壓0.6 V，源補(bǔ)償電壓50 V，脫溶劑氣流量1 000 mL/min，錐孔氣流量150 mL/min，碰撞氣流速0.15 mL/min。

質(zhì)譜條件見表2。

表2 質(zhì)譜條件

1.2.5 測定

內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 前處理方法優(yōu)化

前處理中，酸性提取液能促進(jìn)目標(biāo)化合物的溶解，若加入緩沖鹽、離子對試劑，需使用二氯甲烷溶液萃取凈化。水與二氯甲烷屬于共軛溶液，較長時間離心才能分層，且萃取后的溶液體積較大，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮時，MG和LMG損失嚴(yán)重。以冰乙酸酸化的乙腈提取，使用氧化鋁粉吸附脂肪，為避免堿性和酸性氧化鋁對目標(biāo)化合物吸附，選擇中性氧化鋁粉分散固相萃取。三苯甲烷類屬于弱堿性物質(zhì)，針對水產(chǎn)加工品增加陽離子交換柱進(jìn)一步凈化。陽離子交換小柱要求上樣溶液、淋洗溶液、洗脫溶液pka值應(yīng)逐級升高，且pH值相差2以上，嘗試不同的淋洗和洗脫溶液，選擇酸化乙腈、氨水甲醇溶液時，目標(biāo)化合物損失最小。

2.1.2 色譜條件

目標(biāo)化合物在反相C18色譜柱上有保留，在乙腈中易溶，乙酸銨作為緩沖溶液提供合適的pH值并促進(jìn)生成正離子，因此選擇5 mmol/L乙酸銨與乙腈作為流動相。在梯度洗脫流速0.3 mL/min時，化合物有效分離，峰型較好，保留時間穩(wěn)定，分析時間短，且基線穩(wěn)定干擾少。

多反應(yīng)監(jiān)測譜圖見圖1。

圖1 多反應(yīng)監(jiān)測譜圖

2.1.3 質(zhì)譜條件

目標(biāo)化合物氫鍵供體數(shù)量為4，易形成M+1型分子離子峰，因此采用ESI+模式。首先通過母離子掃描得到MG，LMG，D5-MG，D6-LMG的質(zhì)荷比分別為329，331，334，337 m/z，再通過子離子掃描得到離子碎片，選擇最強(qiáng)豐度作為定量子離子，干擾較小離子作為定性子離子，確定多反應(yīng)監(jiān)測模式的離子對。

2.2 檢出限與定量限

對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以3倍信噪比S/N作為檢出限，10倍信噪比為定量限。確定方法的檢出限 0.2 μg/kg，定量限 0.5 μg/kg。

信噪比見圖2。

2.3 回收率與精密度

圖2 信噪比

選取21批魚、魚片和干海參等樣品，按水產(chǎn)和加工品分成兩類，每類3種，取可食部分，混勻制樣，加入不同質(zhì)量濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)儲備液作為加標(biāo)樣品。每個樣品測定6次，同時測定空白樣品，計算回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。離子化效率高，基線噪音低。

回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié)論

建立了LC-MS/MS測定水產(chǎn)及其加工品中MG，LMG殘留量的方法。簡化前處理步驟，選取合適的提取溶液直接提取，分散固相萃取代替固相萃取柱提純，陽離子交換柱進(jìn)一步凈化，根據(jù)質(zhì)譜分析優(yōu)化選出酸化乙腈和氨水甲醇溶液為最佳的淋洗和洗脫液。該方法具有回收率高、精密度好、檢出限低、干擾小、適用范圍廣等優(yōu)勢，能夠快速、準(zhǔn)確地獲得分析效果。