右美托咪定通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性小體的表達(dá)減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷的機(jī)制研究

彭承旭， 向 紅， 金 濤， 田 香

(湖北省民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院麻醉科, 湖北 恩施 445000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血是臨床常見(jiàn)的一種顱腦出血現(xiàn)象，是腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，在臨床上有較高的發(fā)病率，約占顱腦出血性疾病的10%，該病發(fā)生后起病急促、進(jìn)展快速、危害性大，且致死率、致殘率均較高[1,2]。。隨著分子病理研究的不斷深入，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體-3(NLRP3)炎癥小體已經(jīng)被報(bào)道出與蛛網(wǎng)膜下腔出血的炎性反應(yīng)，可能參與到蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)病過(guò)程中。近些年報(bào)道顯示右美托咪定在創(chuàng)傷性腦損傷、腦缺血等顱腦損傷疾病的治療中也有一定的療效[3]。為此，在本研究中通過(guò)大鼠造模蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，給予右美托咪定干預(yù)治療，并進(jìn)行組間比較，從NLRP3炎性小體的角度探討右美托咪定對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1儀器與材料:儀器:BX-51型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；MDF-40型超低溫冰箱(中科美菱公司)；TDL-5T高速冷凍離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；YZ-250DB超聲波清洗儀(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；ICR-15型電子分析天平(梅特勒托利多公司)；Multiskan Sky型多功能全波段酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)；Leica BOND全自動(dòng)免疫組化分析儀(德國(guó)徠卡公司)。材料:SD大鼠100只，均為雌性，購(gòu)置于我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，鼠齡8～10周，鼠體重180～250g，平均重量(203.21±21.97)g；鹽酸右美托咪定注射液(四川國(guó)瑞藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20143195，規(guī)格:1mL:0.1mg)；生理鹽水(安徽豐源藥業(yè)有限公司)；GABA、Glu、TLR4等相關(guān)檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于上海羅氏診斷試劑公司。

1.2造模、分組、給藥:將100只大鼠分為健康對(duì)照組、模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定中劑量組、右美托咪定高劑量組共5組，每組大鼠各20只，大鼠的鼠齡、鼠重比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠采用分籠飼養(yǎng)，對(duì)于模型組、右美托咪定低劑量組、右美托咪定中劑量組、右美托咪定高劑量組進(jìn)行蛛網(wǎng)膜下腔出血的造模操作。造模操作過(guò)程為:各大鼠以5%水合氯醛按400mg/kg劑量進(jìn)行麻醉，麻醉后進(jìn)行頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法進(jìn)行造模[8]，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，并在近心端預(yù)留結(jié)扎線，然后在頸外動(dòng)脈剪一小口，并去除動(dòng)脈夾，松開(kāi)頸總動(dòng)脈動(dòng)脈夾后即造模成功。模型建立后，存活的大鼠參照Garcia方法鑒定蛛網(wǎng)膜下腔出血模型制模成功[4]。待造模完成后，模型組給予生理鹽水注射、右美托咪定組大鼠分別給予高、中、低劑量的右美托咪定注射液進(jìn)行注射治療。注射方式為腹腔注射，液體量均為5mL。

1.3觀察指標(biāo):連續(xù)給藥治療7d后處死大鼠，對(duì)大鼠的顱腦進(jìn)行解剖，測(cè)量統(tǒng)計(jì)各組大鼠顱內(nèi)蛛網(wǎng)膜下腔出血量和腦內(nèi)含水量，并進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)對(duì)比。采集各組大鼠的靜脈血約2mL，經(jīng)離心分離后得血清樣本。采用酶類免疫吸附實(shí)驗(yàn)法(ELISA)進(jìn)行檢測(cè)大鼠的血清炎性因子包括白介素-Iβ(Interleukin-Ibeta,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)的水平，并進(jìn)行組間對(duì)比。采用免疫組化分析法對(duì)各組大鼠NLRP3炎性小體水平進(jìn)行檢測(cè)統(tǒng)計(jì)對(duì)比。采用Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)對(duì)大鼠的血清炎癥因子和NLRP3炎性小體水平相關(guān)性進(jìn)行分析探討。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血量、腦內(nèi)含水量比較:與健康對(duì)照組大鼠相比，模型組、右美托咪定組大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔出血量、腦內(nèi)含水量均顯著增加，且右美托咪定組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血量、腦內(nèi)含水量均有降低，右美托咪定組隨給藥劑量增加，出血量和含水量均有降低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血量腦內(nèi)含水量比較

注:與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05；與中劑量組比較，^P<0.05

2.2各組大鼠血清炎癥因子、NLRP3水平比較:與健康對(duì)照組大鼠相比，模型組、右美托咪定組大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3水平均有顯著升高，且右美托咪定組均低于模型組，右美托咪定組隨給藥劑量的增加，各項(xiàng)炎癥因子水平逐步降低，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子 NLRP3水平比較

注:與健康對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，&P<0.05；與中劑量組比較，^P<0.05

2.3相關(guān)性指標(biāo)分析:經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析，NLRP3與IL-1β、TNF-α、IL-6呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 大鼠NLRP3炎性小體與炎癥因子水平的相關(guān)性分析

3 討 論

蛛網(wǎng)膜下腔出血是是臨床常見(jiàn)的一種顱腦出血現(xiàn)象，是指指腦底部或腦表面的病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，在臨床上有較高的發(fā)病率，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)生率約占顱內(nèi)出血性疾病的10%?；颊甙l(fā)病后的致死率、致殘率均較高，且患者治療后的預(yù)后效果較差，患者易出現(xiàn)腦損傷等持續(xù)影響患者的生活質(zhì)量[3]。目前，臨床對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血的發(fā)病機(jī)制的研究尚未完全明確，現(xiàn)有的報(bào)道認(rèn)為與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)等因素有關(guān)。其中NLRP3是臨床常見(jiàn)的炎性小體，相關(guān)報(bào)道證實(shí)NLRP3炎性小體與炎癥反應(yīng)擴(kuò)增、血腦屏障破壞、細(xì)胞凋亡和腦水腫加劇有關(guān)[5]。右美托咪定是一種常用的輔助藥物，該藥物為新型的α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，能夠特異性的作用于患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要作用有鎮(zhèn)靜、止痛、抗焦慮、抗交感神經(jīng)癥狀及抗寒戰(zhàn)等效應(yīng)。在本研究中通過(guò)大鼠造模獲得蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，并給予右美托咪定進(jìn)行給藥治療[6]。

本研究表明右美托咪定對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血的治療有改善作用，能夠減少患者蛛網(wǎng)膜下腔出血量和腦水腫含水量。這是因?yàn)橛颐劳羞涠ㄆ渥饔玫臋C(jī)理主要是通過(guò)對(duì)腦組織及神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用達(dá)到，右美托咪定通過(guò)減少體內(nèi)谷氨酸的濃度過(guò)高對(duì)腦部的損傷，有效保護(hù)了海馬神經(jīng)元的功能[7]；其次，右美托咪定可提高腦部組織的氧氣供應(yīng)，改善腦部的血流動(dòng)力學(xué)，減少腦部的缺血缺氧現(xiàn)象的發(fā)生。再者，右美托咪定通過(guò)對(duì)中樞藍(lán)斑核受體的激動(dòng)作用，可阻斷蛋白激酶A和下游產(chǎn)物的磷酸化作用，降低了腦部傷害性神經(jīng)遞質(zhì)程度能量釋放，因而右美托咪定的使用能夠降低蛛網(wǎng)膜下腔出血對(duì)于大鼠早期損傷作用。在各組大鼠炎癥因子水平比較中，與健康對(duì)照組大鼠相比，模型組、右美托咪定組大鼠的IL-1β、TNF-α、IL-6、NLRP3水平均有顯著升高，且右美托咪定組均低于模型組，右美托咪定組隨給藥劑量的增加，各項(xiàng)炎癥因子水平逐步降低。表明右美托咪定的應(yīng)用能降低大鼠的炎性反應(yīng)水平，并且對(duì)NLRP3炎性小體水平有降低作用。經(jīng)相關(guān)性分析顯示，NLRP3與IL-1β、TNF-α、IL-6呈正相關(guān)，進(jìn)一步表明右美托咪定對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血的腦損傷保護(hù)可能與下調(diào)NLRP3炎性小體水平有關(guān)[8]。

綜上所述，對(duì)于蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠進(jìn)行右美托咪定給藥治療后，能夠降低大鼠的蛛網(wǎng)膜下腔出血量和腦內(nèi)含水量，并且隨著給藥劑量的增加出血量有顯著的降低。右美托咪定的應(yīng)用還會(huì)降低大鼠的血清炎癥因子和NLRP3炎性小體水平，并隨劑量增加而呈現(xiàn)規(guī)律性的改變，通過(guò)相關(guān)性分析初步推斷右美托咪定減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠早期腦損傷機(jī)制可能與下調(diào)NLRP3炎性小體水平表達(dá)有關(guān)。