結(jié)締組織生長(zhǎng)因子PD98059和LY294002在調(diào)節(jié)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖遷移中的作用

胡 煜, 周孟君, 李 剛, 劉 斌, 余 靜

(1.四川省綿陽市中心醫(yī)院兒科， 四川 綿陽 621000 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科, 四川 瀘州 646000)

先天性心臟病(CHD)是小兒常見心血管疾患，左向右分流型CHD多并發(fā)肺動(dòng)脈高壓(PAH)，若進(jìn)展為Eisenmenger綜合征則失去治療機(jī)會(huì)。肺血管重構(gòu)是梗阻性PAH的病理學(xué)特征，其中包括肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)的生物學(xué)行為改變，如細(xì)胞外基質(zhì)沉積。PASMC功能受多種細(xì)胞因子調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)基因和蛋白表達(dá)明顯增，且CTGF可促進(jìn)PASMC膠原蛋白分泌，故推測(cè)CTGF與PASMC還有更廣泛的聯(lián)系。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)和三磷酸肌醇激酶(PI3K/PKB)通路參與多種細(xì)胞的增殖遷移 ，故推測(cè)PASMC的增殖遷移也可能經(jīng)這兩條通路[1]。PD98059和LY294002分別為ERK1/2和PI3K通路阻斷劑，本課題以大鼠PASMC為對(duì)象，研究上述兩種阻斷劑能否抑制CTGF刺激下的PASMC增殖遷移。

1 材料與方法

1.1PASMC培養(yǎng)和鑒定:6-8周齡SD大鼠，斷頸處死后取肺動(dòng)脈血管中層肌性組織，眼科剪將其分離為1-2mm3大小塊狀物后接種培養(yǎng)瓶(1～2塊/cm2)，靜置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱貼壁2h后取出培養(yǎng)瓶，緩慢加入M199培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)7-10d可見細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出，待其覆蓋瓶底面積70-80%后傳代至第3代做細(xì)胞爬片，免疫組化檢測(cè)a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)陽性可鑒定為PASMC。將PASMC分為空白組、CTGF組、CP組(CTGF+PD98059)、CL組(CTGF+LY294002)、CPL組(CTGF+PD98059+LY294002)，分別加入含相應(yīng)試劑的M199培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。(試劑濃度:CTGF:50ng/mL,PD98059:20μmoL/L,LY294002:10μmoL/L)

1.2方 法

1.2.1PASMC增殖檢測(cè):接種3-5代細(xì)胞于96孔板，每孔5×103個(gè)，貼壁過夜，棄原液后按分組加入培養(yǎng)基各100ul，分別培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h后用WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑孵育4h后酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光值(OD值)，每組5個(gè)復(fù)孔，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.2PASMC遷移檢測(cè):Transwell接種細(xì)胞于Transwell(8um)小室，1×105個(gè)/室，放入24孔板內(nèi)(事先按分組加入培養(yǎng)基各800ul)，37℃、5% CO2培養(yǎng)分別培養(yǎng)6h、12h后，棉球輕輕抹去小室濾膜上層細(xì)胞，甲醇固定濾膜5min，考馬斯亮藍(lán)染色15min，400倍光鏡下計(jì)數(shù)上下左右中5個(gè)視野穿膜細(xì)胞，每組5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞劃痕:將Culture Insert(培養(yǎng)插件)置于6孔板，于培養(yǎng)插件每孔中加入70ul細(xì)胞懸液(3×105個(gè)/mL)，37℃、5% CO2培養(yǎng)4h細(xì)胞貼壁后移除培養(yǎng)插件(每孔可見500um寬度劃痕)，按分組加入培養(yǎng)基各3mL，繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h后觀察劃痕寬度，Wimasis軟件分析實(shí)驗(yàn)圖片。細(xì)胞骨架:將玻片置于6孔板，每孔接種細(xì)胞3×105個(gè)，37℃、5% CO2培養(yǎng)24h后細(xì)胞爬滿玻片，棄原培養(yǎng)液，按分組加入干預(yù)試劑各3mL，繼續(xù)培養(yǎng)12h、24h后取玻片甲醇固定5min，考馬斯亮藍(lán)染色15min，鏡檢觀察細(xì)胞骨架。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較用LSD-t法，用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PASMC培養(yǎng)和鑒定:顯微鏡下觀察到細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出(圖1)，形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞基質(zhì)均勻分布，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈桿狀或橢圓形，可多個(gè)核仁。細(xì)胞平行生長(zhǎng)，細(xì)胞連接緊密，間隙小，因細(xì)胞穩(wěn)定的增殖周期而使其呈“波谷狀”生長(zhǎng)方式排列(圖2)，α-SMA免疫組化染色為鑒定金標(biāo)準(zhǔn)，如>95%細(xì)胞染色為陽性則為PASMC(圖3)。

2.2細(xì)胞增殖:WST-1法測(cè)OD值描繪細(xì)胞增殖曲線。相比空白組，CTGF刺激PASMC24、48、72、96和120h后增殖水平升高(P均<0.05)；相比CTGF組，CP、CL和CPL組PASMC在干預(yù)24、48、72、96和120h后增殖水平有不同程度下降，其中CPL組下降最顯著(P均<0.05)，見表1，圖4。

2.3細(xì)胞遷移:各組Transwell小室均可觀察到穿膜細(xì)胞，干預(yù)6h和12h后各組細(xì)胞計(jì)數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相比空白組，CTGF組細(xì)胞穿膜數(shù)量增加(P<0.05)；相比CTGF組，CP、CL和CPL組細(xì)胞穿膜數(shù)量減少，CPL組減少最顯著(P均<0.05)，見表2，圖5。細(xì)胞劃痕示干預(yù)12h和24h后各組劃痕寬度計(jì)數(shù)的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相比空白組，CTGF組細(xì)胞劃痕寬度減小(P<0.05)；相比CTGF組，CP、CL和CPL組細(xì)胞劃痕寬度有不同程度增加，CPL組增加顯著(P均<0.05)，見表3，圖6。細(xì)胞骨架染色示干預(yù)12h后可見CTGF組細(xì)胞骨架模糊不清，其余各組清晰可見,且CP、CL和CPL組更加清晰；干預(yù)24h觀察所見各組細(xì)胞骨架清晰度與12h無明顯差異。見圖7。

表1 WST-1檢測(cè)OD值

注:1)與空白組比較，P<0.05；2)與CTGF組比較，P<0.05

表2 Transwell測(cè)PASMC透膜數(shù)

注:1)與空白組比較，P<0.05；2)與CTGF組比較，P<0.05

表3 Culture Insert測(cè)PASMC劃痕寬度

注:1)與空白組比較，P<0.05；2)與CTGF組比較，P<0.05

圖1 PASMC原代培養(yǎng) ×100倍

圖2 PASMC傳代培養(yǎng) ×200倍

圖3 PASMC α-SMA免疫組化染色×200倍

圖4 PASMC增殖趨勢(shì)圖

圖5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移(×400倍)

圖6 細(xì)胞劃痕檢測(cè)細(xì)胞遷移(×100倍)

圖7 考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞骨架(×400倍)

3 討 論

左向右分流型CHD常并發(fā)PAH和進(jìn)行性右心衰竭，充血性PAH可導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)改變包括肺血管收縮、重構(gòu)和血栓形成而出現(xiàn)梗阻性PAH ，最終導(dǎo)致Eisenmenger綜合征。肺血管重構(gòu)是PAH的病理特征，在肺血管重構(gòu)中存在血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)增殖遷移等現(xiàn)象，表現(xiàn)為肺小動(dòng)脈中膜增厚、新生肺小血管形成和非肌性小動(dòng)脈肌化等。PASMC常隨新生肺小血管中成纖維細(xì)胞增殖而分裂，并在增殖遷移過程中伴隨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(如膠原蛋白、纖維連接蛋白等)沉積從而導(dǎo)致肺血管重構(gòu)、肺組織纖維化及順應(yīng)性降低。

多種因素與PASMC增殖遷移有關(guān)，如低氧、PDGF、VEGF和CTGF等[2,3]。CTGF是富含半胱氨酸的分泌肽，由血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞合成分泌，它與心臟、血管、腎臟、肺及肝臟等組織器官纖維化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Bradley A等通過建立大鼠PAH模型，觀察到肺小動(dòng)脈有內(nèi)膜膠原沉積并伴有內(nèi)皮功能障礙，肺血管內(nèi)PASMC增多，肺小動(dòng)脈CTGF水平升高[4]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，CTGF刺激下的PASMC增殖速度增快，Transwell穿模細(xì)胞數(shù)目增加，細(xì)胞劃痕融合速度加快并在24h內(nèi)基本消失，細(xì)胞骨架模糊不清，說明細(xì)胞增殖遷移現(xiàn)象較顯著。細(xì)胞增殖速度加快與細(xì)胞周期縮短有關(guān)，而細(xì)胞遷移則為增殖提供了空間，細(xì)胞遷移是細(xì)胞增殖、ECM和細(xì)胞骨架變化共同作用的結(jié)果。CTGF能增加PDGF-BB、TGF-β和IGF的作用，在體內(nèi)PDGF-BB和IGF均可刺激細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)低氧狀態(tài)下血管平滑肌細(xì)胞中CTGF表達(dá)增加并能提高的增殖和遷移率，而抗CTGF抗體可阻止這一現(xiàn)象。另有研究表明[5]，TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移可由CTGF可介導(dǎo)，TGF-β除直接影響心臟修復(fù)細(xì)胞外還可能通過誘導(dǎo)下游效應(yīng)物的表達(dá)而發(fā)揮作用，如基質(zhì)細(xì)胞蛋白CTGF或內(nèi)皮素(ET-1),以上研究提示CTGF與PASMC增殖遷移有關(guān)。

CTGF是一種36～38 kDa的富含半胱氨酸的分泌蛋白，其促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移的機(jī)制尚不清楚，推測(cè)CTGF可能是某些整合素復(fù)合體的配體[6]。研究發(fā)現(xiàn)貓腎臟近端小管細(xì)胞的磷脂酸受體和Gαq蛋白可以Rho/Rho-激酶和αvβ6整合素依賴的方式激活潛在的TGF-β并促進(jìn)PDGF-B和CTGF的產(chǎn)生和分泌，CTGF介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞基質(zhì)沉積及肝纖維化過程中整合素αvβ1 siRNAs表達(dá)增加[6]，也可通過αvβ3整合素誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞增殖，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)整合素β1和β3信號(hào)途徑能介導(dǎo)CTGF誘導(dǎo)的PASMC增殖遷移和細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)，故推測(cè)CTGF可能與細(xì)胞表面的整合素受體結(jié)合產(chǎn)生第二信使經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路啟動(dòng)下游基因表達(dá)，從而通過增加DNA合成、改變細(xì)胞周期和骨架蛋白合成等方式來促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是真核生物信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PD98059是非ATP競(jìng)爭(zhēng)性絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制劑，能特異地抑制MEK-1-介導(dǎo)的MAPK活化，抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化，并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白E/Cdk2和D1/Cdk4水平，導(dǎo)致細(xì)胞阻斷在G1期。三磷酸肌醇激酶(PI3K/PKB)通路是許多細(xì)胞因子的下游信號(hào)傳導(dǎo)通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2/M期抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)控細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)細(xì)胞增殖遷移和血管生成[7]。LY294002可以通透細(xì)胞，特異性抑制PI3K并抑制PI3K/Akt信號(hào)途徑。本研究觀察到PASMC在PD98059和/或LY294002干預(yù)下增殖速度較CTGF刺激組減慢，且抑制程度隨著干預(yù)濃度增加，Transwell穿模細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞劃痕寬度減小速度變緩，細(xì)胞骨架解聚和重構(gòu)的現(xiàn)象不明顯，細(xì)胞骨架清晰。另有研究發(fā)現(xiàn)[8,9]，PD98059能抑制人皮膚成纖維細(xì)胞CTGF的表達(dá)，LY294002可通過抑制PI3K信號(hào)通路而減少腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)，并可協(xié)同其他化療藥物抑制CTGF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。這些研究提示CTGF促進(jìn)PASMC增殖遷移過程可能經(jīng)過ERK1/2和PI3K/PKB信號(hào)通路。

本研究發(fā)現(xiàn)PAH肺血管重構(gòu)因素復(fù)雜，CTGF可能通過刺激PASMC增殖遷移的方式加重肺血管重構(gòu)。PASMC增殖遷移過程可被PD98059和/或LY294002抑制，提示它們所阻斷的ERK1/2和PI3K通路可能參與了CTGF刺激下的PASMC增殖遷移，并可能是阻斷或減輕肺血管重構(gòu)的新靶點(diǎn)。