組成型分泌表達蛋白酶的重組糞腸球菌的構建及應用

郭建軍，曾靜，袁林，魏國汶

(江西省科學院微生物研究所，江西 南昌,330096)

目前我國飼料產業面臨的主要問題是蛋白質飼料原料等資源匱乏，對進口的依存度很高，其中75%以上的大豆依靠進口[1]。隨著國際大豆價格走高，畜禽養殖成本也將逐漸加大。此外，蛋白質飼料的利用率偏低，這影響了畜禽產品的質量，也增加了畜禽養殖的成本[2]。因此，尋找優質、廉價的蛋白飼料原料替代資源，以及利用現代生物技術手段改善動物飼料的品質，提高動物飼料中蛋白質的利用率，是當前我國飼料工業的重要發展方向[3-4]。

在豬禽營養中，高效的蛋白質消化率有利于更有效、更充分地實現飼料原料的應用，保證生產效率，維持豬禽腸道健康和減少環境中氨氮的排放[5-9]。除了對蛋白質營養的貢獻外，蛋白酶也可以協助釋放其他養分，降解蛋白質類抗營養因子和抗原[10]。因此如何提高動物粗飼料中蛋白質利用率是許多研究者一直關注的重要課題。解決該問題的一種有效方法就是利用產蛋白酶的微生物來提高動物粗飼料中蛋白質的降解率。隨著基因工程技術的發展以及對乳酸菌表達系統的深入研究，利用基因工程技術來構建表達外源蛋白酶的乳酸菌基因工程菌，并利用該乳酸菌基因工程菌直接發酵處理動物粗飼料，或者將其作為活菌制劑來幫助動物提高粗飼料中蛋白質降解率都是便捷、有效的方法[11]。

利用乳酸菌作為宿主菌來表達外源蛋白酶具有許多優勢，例如易構建獲得安全級的基因表達系統，對膽鹽具有較好的耐受能力等[12]。并且大多數乳酸菌屬于動物胃腸道的共生菌，可以在動物特定的消化道區域定植，這使其成為表達外源水解酶的理想工具[13-16]。但是乳酸菌表達系統與其他原核表達系統或真核表達系統相比仍存在外源蛋白質表達量偏低、遺傳背景不夠清楚等問題[17]。乳酸菌作為基因工程菌進行應用時，能否高效穩定的將外源蛋白質分泌至胞外發揮生物學作用至關重要。組成型表達系統可以在無其他信號刺激的條件下使乳酸菌宿主菌持續穩定表達外源蛋白質[18]，高效的乳酸菌信號肽可以有效引導外源蛋白質分泌至胞外[19-20]。因此，構建組成型分泌表達外源蛋白質的重組乳酸菌具有重要意義，在生產實踐中也具有更大的應用潛力。

本研究以本實驗室前期從健康仔豬腸道黏膜上分離純化得到的具有優良益生特性的糞腸球菌EXW27 為宿主菌，以大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒pSIP401為表達載體的基礎框架，通過對表達載體中啟動子和信號肽進行替換，來構建組成型分泌表達地衣芽孢桿菌BacilluslicheniformisBBE11-1中角蛋白酶Ker[21]的重組糞腸球菌。并進一步利用該重組糞腸球菌對豆粕進行固態發酵處理，通過比較發酵前后豆粕的各項指標[22]來研究該工程菌用于動物粗飼料體外發酵或者作為活菌制劑的可行性。本研究對于探索制備新型微生態制劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養基

本研究所用大腸桿菌EscherichiacoliJM109、糞腸球菌EnterococcusfaecalisEXW27、大腸桿菌-乳酸菌穿梭質粒pSIP401、重組質粒pSTOP1622-kerhds均由本實驗室保存；所用培養基為LB培養基和MRS培養基。

1.1.2 主要實驗材料

KOD-Plus-neo DNA聚合酶，日本Toyobo公司；DNA限制性內切酶、T4DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質Marker，美國Fermentase公司；DNA膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒E.Z.N.A.，美國Omega Bio-tek公司； Chelating SepharoseTMFast Flow，美國GE Healthcare公司；Bradford法蛋白濃度測定試劑盒、PCR引物，上海生工生物工程股份有限公司；豆粕，江西鑫維生物技術有限公司；實驗所用試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器與設備

Mastercycler gradient 型PCR儀，美國Eppendorf公司；TY04S-3C型凝膠成像系統，北京君意東方電泳設備有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；SP-752PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子克隆技術和表達產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析

分子克隆技術和表達產物的SDS-PAGE分析參照文獻[23]進行。

1.2.2 重組質粒pSIP401Z-kerhds的構建與鑒定

基于蛋白酶ker的堿基序列，設計引物P1和P2，如表1所示。以重組質粒pSTOP1622-kerhds為模板，采用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增基因ker中不含信號肽的結構基因kerhds。PCR擴增條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，74 ℃ 1 min，35個循環；74 ℃ 5 min。擴增產物經XhoI和KpnI雙酶切，連接至經同樣雙酶切處理的載體pSIP401，構建重組質粒pSIP401-kerhds。將連接產物轉化大腸桿菌E.coliJM109感受態細胞，將轉化產物全部涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，于37 ℃過夜培養。挑取LB固體平板上轉化子，提取其中所含重組質粒。采用XhoI和KpnI雙酶切重組質粒鑒定是否有外源基因的插入。

注：下劃線標注的部分為限制性酶切割位點

在質粒pSIP401-kerhds的基礎上，參照文獻[24]中啟動子替換方法，根據質粒pSIP401和基因ker的堿基序列設計引物P3和P4，將重組質粒pSIP401-kerhds中啟動子替換為本實驗室前期研究工作篩選得到的糞腸球菌中高組成型表達啟動子p10，構建重組質粒pSIP401Z-kerhds。其中p10的堿基序列為：AGATCTGCATAAAAAGTTCTTGACACTATATTAAGG CATTGTTAAGATATAGAAATAGCG。具體實驗步驟如下：以重組質粒pSIP401-kerhds為模板，采用引物P3和P4進行PCR擴增。PCR擴增條件為：98 ℃ 5 min；98 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，74 ℃ 10 s，30個循環；74 ℃ 5 min。擴增產物經BglII和NcoI雙酶切，連接至經同樣雙酶切處理的載體pSIP401-kerhds，構建重組質粒pSIP401Z-kerhds。將連接產物轉化大腸桿菌E.coliJM109感受態細胞，將轉化產物全部涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，于37 ℃過夜培養。挑取LB固體平板上轉化子，提取其中所含重組質粒。將重組質粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行比對確認。

1.2.3 信號肽篩選載體的構建與鑒定

根據文獻[25]提供的糞腸球菌來源的信號肽的基因序號，在NCBI中查詢基堿基序列。采用化學全合成方法合成包含限制性酶切位點NcoI和XhoI以及信號肽堿基序列的DNA片段：5’-AGCCATGG(NcoI)-信號肽堿基序列-CTCGAG(XhoI)TG-3’。所合成的DNA片段經NcoI和XhoI雙酶切，連接至經同樣雙酶切處理的載體pSIP401Z-kerhds，構建信號肽篩選載體。將連接產物轉化大腸桿菌E.coliJM109感受態細胞，將轉化產物全部涂布于含200 μg/mL紅霉素的LB固體平板上，于37 ℃過夜培養。挑取LB固體平板上轉化子，提取其中所含重組質粒。將重組質粒送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序，并與對應基因序列進行比對確認。

表2 糞腸球菌來源的信號肽Table 2 signal peptides from Entercoccus faecalis

1.2.4 糞腸球菌E.faecalisEXW27的電擊轉化

糞腸球菌E.faecalisEXW27的電擊轉化方法參照參考文獻[26]進行。將重組質粒電擊轉化糞腸球菌E.faecalisEXW27，將轉化產物全部涂布于含10 μg/mL 紅霉素的MRS固體平板上，37 ℃培養24 h，獲得重組糞腸球菌。

1.2.5 蛋白酶在糞腸球菌中的組成型分泌表達和純化

接種重組糞腸桿菌單克隆到含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養基中，用250 mL三角瓶進行培養，其中培養基的裝液量為100 mL，于37 ℃靜置培養，培養時間為24 h。然后轉接該培養物于新鮮含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養基中，用250 mL三角瓶進行培養，其中培養基的裝液量為100 mL，接種量為3%(體積分數)，于37 ℃靜置培養，培養時間為36 h。待培養結束后，于4 ℃下8 000 r/min離心5 min，分別收集菌體沉淀和發酵液上清，采用SDS-PAGE檢測發酵液上清和重組糞腸球菌胞內的蛋白酶表達情況，并測定發酵液上清和重組糞腸球菌胞內的蛋白酶酶活。其中發酵液上清直接用于蛋白酶酶活檢測；重組糞腸球菌菌體采用50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0緩沖液重懸后，置于冰上采用超聲波處理菌體細胞至菌體懸液變為均一溶液后，再用于蛋白酶酶活檢測。

采用Ni2+親和層析柱對發酵上清液中目的蛋白質進行純化，用250 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫，即得到純化后的重組蛋白酶。利用SDS-PAGE檢測重組蛋白酶的純度，并采用Bradford法[27]測定重組蛋白酶的濃度。

1.2.6 蛋白酶的酶學性質分析

1.2.6.1 蛋白酶的酶活力測定

取250 μL酶液于離心管中，向實驗組管中加入250 μL 20 g/L酪蛋白底物溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 9.0)，對照組中加入500 μL 40%(質量濃度)TCA溶液，搖勻。于40 ℃反應30 min后，立即向實驗組中加入500 μL 40%(質量濃度)TCA溶液，對照組中加入250 μL 20 g/L酪蛋白底物溶液，并混勻。室溫放置15 min后，12 000×g離心10 min，轉移上清液于新的離心管中，并于280 nm處測定光吸收值。蛋白酶活力單位(U)定義為：在40 ℃、pH 9.0的條件下，每分鐘使上述反應體系中上清液的A280nm升高0.01所需要的酶量為1 U。重組糞腸球菌胞外蛋白酶的比酶活力(U/mL)定義為：在40 ℃、pH 9.0的條件下，單位體積(mL)發酵上清液每分鐘使上述反應體系中上清的A280nm升高0.01所需要的酶量為1 U。

1.2.6.2 蛋白酶的最適反應溫度

按照上述反應體系混合酶液和底物，分別于20～80 ℃反應30 min，測定不同溫度條件下酶活力。將所測得的最高酶活力定義為100%，并以相對酶活力的百分比對溫度作圖，確定其最適反應溫度。

1.2.6.3 蛋白酶的最適反應pH和pH穩定性

將酶液與不同pH 的20 g/L酪蛋白底物溶液混合，于40 ℃下進行酶活力測定。采用不同緩沖液配制不同pH的20 g/L酪蛋白底物溶液：50 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸緩沖液(pH 3.0～7.0)、50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0～10.0)。將所測得的最高酶活力定義為100%，并以相對酶活力的百分比對pH作圖，確定其最適反應pH。

將酶液與不同pH值的Britton-Robinson緩沖液(pH 2.0～10.0)混合，分別于40 ℃保溫2 h后取出樣品，根據如上反應體系測定酶活力。將未處理酶液的酶活力定義為100%，并以相對酶活力的百分比對pH值作圖，評價酶的pH穩定性。

1.2.6.4 蛋白酶于膽鹽溶液中的穩定性

將酶液與不同濃度的膽鹽溶液混合，混合溶液中膽鹽終質量濃度分別為0、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%。將混合物于40 ℃保溫2 h后取出樣品，根據如上反應體系測定酶活力。將未處理的酶液的酶活力定義為100%，并以相對酶活力的百分比對膽鹽質量濃度作圖，評價酶于膽鹽溶液中的穩定性。

1.2.7 豆粕固態發酵實驗

1.2.7.1 糞腸球菌的制備

挑取新鮮的糞腸球菌單菌落，接種于15 mL 含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養12 h后得到一級種子液，按照1%(體積分數)接種于250 mL 含10 μg/mL紅霉素的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養36 h，菌體濃度達到109CFU/mL。

1.2.7.2 豆粕的固態發酵

將風干的豆粕、水、糖蜜以及糞腸桿菌菌液按照不同的配比混合均勻后，置于經無菌處理的自封袋中，封口置于37 ℃培養箱中發酵48 h。取出后55 ℃烘干、粉碎，進行樣品的pH值、粗蛋白質含量、小肽含量、粗蛋白質體外消化率的檢測。以上所述水的加入量占豆粕總質量的50%，糖蜜原液的加入量占豆粕總質量的3%，菌液接種量占豆粕總質量的5%。

1.2.7.3 樣品的粗蛋白質含量檢測

稱取1 g豆粕樣品、0.2 g CuSO4、6 g K2SO4，混合均勻后放入消化管中，向其中加入10 mL H2SO4，然后將消化管放到消化裝置上消化(420 ℃、2 h)，將消化好的樣品用凱氏定氮儀測定其中蛋白質含量。

1.2.7.4 樣品的小肽含量檢測

發酵前后豆粕中小肽含量的測定參照參考文獻[2]進行。

1.2.7.5 樣品的粗蛋白質體外消化率檢測

準確稱取1 g豆粕樣品于100 mL三角燒瓶中，加入10 mL、3 mg/mL、pH 2.0的胃蛋白酶(1∶3 000，質量比)溶液，37 ℃恒溫振蕩(180 r/min)水解6 h。取出后立即滴加少許10 mol/L的NaOH溶液調節pH至中性，再加入50 mL、0.5 mg/mL、pH 7.6的胰蛋白酶(1∶250，質量比)溶液，37 ℃恒溫振蕩(180 r/min)水解18 h。取出后用50 g/L TCA溶液分3次，每次5 mL清洗三角瓶轉入100 mL離心管中，以沉淀未消化的大分子蛋白質。空離心管事先編號并稱重。在4 ℃、8 000×g條件下離心20 min，小心去除上清液，連同離心管一起置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，記錄離心管質量，2次質量差即為殘渣質量。將豆粕樣品與殘渣一起利用凱氏定氮儀進行粗蛋白質含量的測定。粗蛋白質體外消化率(CP·Dig)按照公式(1)計算：

(1)

式中：m0，初始豆粕樣品質量，m0=1 g；m1，殘渣質量，g；CP0，初始豆粕樣品中粗蛋白含量，%；CP1，殘渣中粗蛋白含量，%。

1.3 數據分析

以上每個實驗做3個平行。運用軟件SigmaPlot 12.5對試驗數據進行統計分析并作圖，數據均以x±s表示。

2 結果與分析

2.1 組成型分泌表達蛋白酶Ker的重組糞腸球菌的構建

本研究為實現蛋白酶Ker在糞腸球菌EXW27中的組成型分泌表達，首先采用本實驗室前期研究工作篩選得到的糞腸球菌中高組成型表達啟動子p10替換表達載體pSIP401-kerhds中啟動子，獲得組成型表達載體pSIP401Z-kerhds。然后根據糞腸球菌來源的8種信號肽的堿基序列，設計構建蛋白酶Ker在糞腸球菌EXW27中組成型分泌表達的信號肽篩選載體pSIP401Z-s1-kerhds、pSIP401Z-s2-kerhds、pSIP401Z-s3-kerhds、pSIP401Z-s4-gtamyhds、pSIP401Z-s5-kerhds、pSIP401Z-s6-kerhds、pSIP401Z-s7-kerhds、pSIP401Z-s8-kerhds。將以上信號肽篩選載體分別電擊轉化糞腸球菌EXW27，獲得重組糞腸球菌。以轉化了質粒pSIP401的重組糞腸球菌為陰性對照C1，以轉化了重組載體pSIP401Z-kerhds的重組糞腸球菌為陰性對照C2。重組糞腸球菌于37 ℃靜置發酵，待發酵結束后，經離心分別收集發酵上清液和菌體沉淀。發酵上清液直接用于蛋白酶的酶活力測定和SDS-PAGE檢測，菌體沉淀經超聲波破碎處理后再用于蛋白酶的酶活力測定和SDS-PAGE檢測。

重組糞腸球菌的發酵上清液和細胞的蛋白酶比酶活力測定結果如圖1所示。陰性對照C1(即轉化了質粒pSIP401的重組糞腸球菌)的發酵上清液和細胞中蛋白酶的比酶活力較低。陰性對照C2(即轉化了重組載體pSIP401Z-kerhds的重組糞腸球菌)的發酵上清液中蛋白酶的比酶活力較低，而其胞內蛋白酶的比酶活力較高，即未經信號肽引導，重組Ker主要位于重組糞腸球菌的細胞內。而來源于糞腸球菌的8種信號肽均能引導重組Ker分泌至胞外，其中信號肽S6的引導效率優于其他信號肽。經信號肽S6引導，該重組糞腸球菌的發酵上清液中蛋白酶的比酶活力可達到125.37 U/mL。

C1-pSIP401；C2-pSIP401Z-kerhds；S1-pSIP401Z-s1-kerhds；S2-pSIP401Z-s2-kerhds；S3-pSIP401Z-s3-kerhds；S4-pSIP401Z-s4-kerhds；S5-pSIP401Z-s5-kerhds；S6-pSIP401Z-s6-kerhds；S7-pSIP401Z-s7-kerhds；S8-pSIP401Z-s8-kerhds圖1 不同信號肽對比酶活力的影響Fig.1 Signal peptide dependence of α-amylase activity

重組糞腸球菌的發酵上清液和細胞的SDS-PAGE檢測結果如圖2和圖3所示。圖2顯示轉化了不同信號肽篩選載體的重組糞腸球菌的發酵上清液中均有1條約為30 kD的蛋白質條帶，而陰性對照C1和陰性對照C2的發酵上清液中未見明顯的大小為30 kD的蛋白質條帶。并且使用信號肽S6后，重組糞腸球菌發酵上清液中重組Ker的表達量明顯提高，這與胞外蛋白酶的比酶活力測定結果是一致的。圖3顯示陰性對照C2以及轉化了信號肽篩選載體的重組糞腸球菌的發酵菌體中均能觀察到約36 kD的蛋白質條帶，而陰性對照C1的發酵菌體中未能明顯觀察到大小相同的蛋白質條帶。該36 kDa的蛋白質條帶可能是未經信號肽引導分泌至胞外而滯留在胞內的蛋白質前體物質。

M-蛋白質Marker；C1、S1～S8、C2圖2 重組糞腸球菌發酵上清液的SDS-PAGE檢測Fig.2 SDS-PAGE analysis of fermentation supernate ofrecombinant E. faecalis注：圖中箭頭標示為目的蛋白。同圖1(下同)

圖3 重組糞腸球菌細胞的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant E. faecalis

2.2 重組Ker的表達與酶學性質研究

2.2.1 重組Ker在糞腸球菌EXW27中表達及純化

對轉化了重組載體pSIP401Z-s6-kerhds的重組糞腸球菌進行發酵培養。待發酵結束后，對培養物進行離心處理，收集發酵上清液，并采用Ni2+親和層析柱對發酵上清液中目的蛋白質進行純化。重組蛋白酶Ker在糞腸球菌EXW27中的組成型分泌表達及純化的SDS-PAGE檢測分析結果如圖4所示。重組蛋白酶Ker的分子質量約為30 kDa，與理論值基本一致。

Ker-經Ni2+親和層析柱純化后的重組Ker圖4 重組Ker在糞腸球菌EXW27中表達及純化的SDS-PAGE檢測Fig.4 SDS-PAGE analysis of expression and purificationof recombinant Ker in E. faecalis EXW27

2.2.2 溫度對重組Ker酶活力的影響

按照蛋白酶酶活力測定反應體系將混合酶液和底物，分別于20～80 ℃反應30 min，測定不同溫度條件下酶活力，將所測得的最高酶活力定義為100%，并以相對酶活力的百分比對溫度作圖，確定重組Ker的最適反應溫度，結果如圖5所示。重組Ker的最適反應溫度為40 ℃，此時比酶活力為1 236.91 U/mg。

圖5 溫度對重組Ker酶活力的影響Fig.5 Temperature dependence of protease activity ofrecombinant ker

2.2.3 pH值對重組Ker酶活力的影響

將酶液于不同pH 3.0～9.0條件下測定重組Ker的酶活力，將所測得的最高酶活力定義為100%，然后以相對酶活力對pH值作圖，結果如圖6所示。

圖6 pH對重組Ker酶活力的影響Fig.6 pH dependence of protease activity of recombinant Ker

重組蛋白酶Ker的最適反應pH值為9.0，并且重組Ker在pH 5.0～10.0范圍內具有50%以上相對酶活力。此外，重組蛋白酶Ker的pH穩定性如圖7所示，其在pH 5.0～10.0范圍內于40 ℃保溫2 h仍具有50%以上的剩余酶活力。以上研究結果表明，蛋白酶Ker屬于堿性蛋白酶，其在堿性pH值范圍內酶活力最高，穩定性最強，因此在小腸的pH值條件[28]下可以高效工作；在胃腸道前段pH值為3.0～5.0條件[28]下，重組Ker仍具有較高的酶活力和pH穩定性。

圖7 pH對酶穩定性的影響Fig.7 pH stability of protease activity

2.2.4 重組Ker在膽鹽溶液中的穩定性

將重組蛋白酶Ker于40 ℃分別于0～3.0 g/L膽鹽溶液中保溫2 h，測定其相對酶活力，分析其在膽鹽溶液中穩定性，結果如圖8所示。重組蛋白酶Ker在0～3.0 g/L膽鹽溶液中具有85%以上相對酶活力，多數動物腸道膽鹽質量濃度范圍為0.3～3.0 g/L[28]，即重組蛋白酶Ker對動物腸道膽鹽具有較好的耐受性。

圖8 重組Ker于膽鹽溶液中的穩定性Fig.8 Stability of recombinant Ker in bile salts

2.3 豆粕固態發酵結果

采用本研究構建的組成型分泌表達蛋白酶Ker的重組糞腸球菌對豆粕進行固態發酵，以接種糞腸球菌EXW的豆粕樣品為對照，并測定發酵前后豆粕樣品的pH值、粗蛋白質含量、小肽含量以及粗蛋白質體外消化率，結果如表3所示。豆粕原料經過糞腸球菌固態發酵處理后，各項指標均發生明顯變化，并且經本研究所獲得的重組糞腸球菌處理后的各項指標優于經糞腸球菌EXW27發酵處理后的。與經糞腸球菌EXW27發酵處理的豆粕樣品相比，經本研究所獲得的重組糞腸球菌發酵處理后的豆粕樣品的pH值更低，粗蛋白質含量、小肽含量以及粗蛋白質體外消化率更高。其中pH值降低了15.47%，粗蛋白質含量提高了12.51%，小肽含量提高了186.69%，粗蛋白質體外消化率提高了29.85%。這表明，經過重組糞腸球菌發酵處理豆粕，可更有效降解豆粕中蛋白質，并產生更多小分子酸。

表3 豆粕固態發酵實驗結果Table 3 results of solid state fermentation of soybean meal

3 結論

本研究構建了組成型分泌表達蛋白酶Ker的重組糞腸球菌，其胞外蛋白酶的比酶活力可達125.37 U/mL。重組蛋白酶Ker的最適反應溫度為40 ℃，最適反應pH為9.0，在pH值5.0～10.0范圍內具有較高的相對酶活和穩定性，并對膽鹽溶液具有較好的耐受性。重組蛋白酶Ker的酶學性質使其適用于動物腸道環境。此外，豆粕固態發酵實驗表明，與野生型糞腸球菌EXW27相比，重組糞腸球菌可以更有效降解豆粕中蛋白質。本研究表明該重組糞腸球菌用于動物粗飼料體外發酵或作為活菌制劑具有一定的效果。