硅量子點熒光傳感器快速檢測鮮奶中的四環素

楊彩玲，趙雪珺，李建穎，趙國虎，2，張麗，曹文濤

1(蘭州城市學院 化學化工學院，甘肅 蘭州，730070) 2(“城市環境污染控制”甘肅省高校省級重點實驗室，甘肅 蘭州，730070)3(西北師范大學 化學化工學院，甘肅 蘭州，730070)

四環素(tetracycline，TET)是一種價格低廉且最為常用的廣譜性抗生素，能有效抑制革蘭氏陽性和陰性細菌、立克次體、濾過性病毒、螺旋體和寄生蟲等感染[1]，作為飼料添加劑和治療藥物被大量用于預防和治療奶牛乳房炎等嚴重疾病，但使用不當或濫用會導致牛奶中過量殘留，對消費者健康造成危害，如引起過敏反應或抗藥性、損害肝臟、使腸胃功能紊亂等[2-3]。國際衛生組織、歐盟和我國規定四環素在牛奶中的最大殘留限量為100 μg/L[4-5]。但即使牛奶中殘留水平很低，長期飲用也會在人體內蓄積，增大健康風險。我國乳業自“三聚氰胺”事件之后，乳品質量有了很大提高，但迄今為止，鮮牛奶中抗生素殘留超標現象還時有發生，特別是一些個體散賣的鮮牛奶[6-9]，因此，監測四環素在鮮牛奶中的殘留情況十分必要。現有的四環素殘留檢測方法主要有酶聯免疫法、高效液相色譜法、液質聯用法、毛細管電泳法等[10]。酶聯免疫法抗體制備時間長，穩定性差；色譜法靈敏度高，可以多組分同時測定，但儀器昂貴、操作復雜耗時，還需要專業的操作人員，限制了它們在現場和實時檢測中的應用。因此，建立一種簡便、快速、靈敏的四環素測定方法，對牛奶質量控制具有重要意義。

近年來，基于量子點的熒光傳感分析方法因靈敏度高、選擇性好、響應時間短、操作簡便及成本低等諸多優點而備受關注，已廣泛應用于藥物殘留[11-14]、生物毒素[15]、違禁添加[16]等食品安全檢測。在抗生素檢測方面，毛永強[13]、YANG等[17]分別通過制備CdTe量子點和碳量子點對牛奶中的土霉素和魚肉中的四環素進行了靈敏測定。相比于金屬半導體量子點和碳量子點，硅量子點(silicon quantum dots, SiQDs)不僅水溶性好，光穩定性強，無毒，并且擁有高的熒光量子產率和豐富的硅源，在分析檢測、生物成像、藥物傳遞等領域應用前景廣闊[18-21]。本文以水熱法合成硅量子點，利用四環素能有效猝滅硅量子點熒光，首次提出了基于硅量子點熒光傳感的四環素檢測新方法，應用于鮮牛奶中四環素殘留的測定，并對傳感機理進行了研究，旨在為四環素殘留的快速檢測提供一種新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TECNAIG2型場發射透射電子顯微鏡，美國FEI公司；FLS920型穩態/瞬態熒光光譜儀，英國EI公司；NEXUS 670型紅外光譜儀，美國 Thermo Nicolet公司；RF-5301型熒光分光光度計，日本島津公司；Tu-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

無水檸檬酸、KCl、MgCl2、CaCl2、NaCl、硝酸鋅、FeCl3，廣州化學試劑廠；半胱氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-苯丙氨酸、N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，上海阿拉丁試劑公司；磷酸、醋酸、硼酸、維生素C，國藥集團化學試劑公司；四環素、土霉素、紅霉素，上海恒遠生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖，重慶茂業化學試劑有限公司；乳糖、EDTA，成都市科龍化工試劑廠。以上試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 SiQDs的制備

SiQDs的制備參照文獻[22]并修改如下：在50 mL錐形瓶中加入5 mL 超純水，然后在攪拌下依次加入50 mg無水檸檬酸和1.0 mL AEAPMS，充分攪拌后將上述混合溶液轉移至聚四氟乙烯高壓反應釜中，240 ℃反應2 h，自然冷卻至室溫。準確移取250 μL SiQDs 溶液加水稀釋并定容至50 mL，儲存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 熒光測定

在10 mL比色管中，依次加入一定體積不同濃度四環素標準溶液和30 μL上述稀釋后的SiQDs溶液，用pH 7.0的B-R緩沖溶液稀釋定容至5.0 mL，搖勻，靜置1 min后在室溫及激發光波長為370 nm條件下測定體系熒光光譜(激發和發射狹縫寬度均為5 nm)。根據lg(F0/F)與C(四環素濃度)繪制工作曲線(F0和F分別代表未加入和加入 TET 時的熒光強度)。

1.2.3 牛奶樣品的處理和測定

生鮮牛奶購自當地7個不同散養售賣點。每個點相隔1 d購買1份，各買3份，共收集樣品21份，所有樣品均于購買當天處理后冰箱冷藏保存。樣品處理過程為：準確移取鮮奶5.0 mL，加入含有20 mmol/L EDTA的McIlvaine buffer 緩沖溶液(pH 5.0)3 mL，質量分數10%的三氯乙酸2 mL，渦旋振蕩5 min，之后在4 ℃ 10 000 r/min下離心10 min以脫去蛋白質，再向上清液中加入2 mL氯仿渦旋振蕩5 min以除去脂肪并再次離心。取上清液用1 mol/L NaOH溶液調節pH為7.0，經0.45 μm微孔膜過濾后準確移取4.5 mL,按1.2.2的方法制備待測樣品溶液進行熒光測定，平行測定3次。

2 結果與討論

2.1 量子點的形貌結構、光學性質及穩定性

a-SiQDs的TEM圖片;b-SiQDs的紅外光譜圖圖1 SiQDs 的表征Fig.1 Characterization of SiQDs

通過FLS920型穩態/瞬態熒光光譜儀測量[23]并計算該量子點的絕對熒光量子產率為18.93%。根據圖2-a SiQDs在不同激發波長下掃描的發射光譜圖，該量子點發射峰位置與激發光無關，說明所制備的SiQDs的發射光不具有激發光依賴特性，但發射光強度隨激發波長的增加先增大后減小，在370 nm達到最大。SiQDs的紫外吸收光譜和熒光激發、發射光譜如圖2-b所示，230 nm 處出現的吸收峰可能是羰基發生π-π*電子躍遷引起，同時SiQDs 表面的官能團發生n-π*躍遷造成了352 nm處出峰。SiQDs 最佳激發波長為370 nm，最佳發射波長為465 nm；內插圖顯示，SiQDs在自然光下接近無色，365 nm紫外光照射下發出明亮的藍光。

a-不同激發波長下的熒光光譜圖;b- UV-vis、熒光激發和發射光譜、自然光和365 nm下照片圖2 SiQDs的光譜圖Fig.2 The spectrum of SiQDs

測定不同酸度(pH 3～12)B-R緩沖溶液中SiQDs 的熒光強度發現，當pH 3時，SiQDs 的熒光強度相對較低，pH 在4～9之間時，SiQDs 的熒光強度較高且穩定；而當 pH>9 時，其熒光強度又逐漸增大。這主要是由于SiQDs 表面官能團的質子化-去質子化作用引起的。此外，向溶液中加入一定濃度NaCl，觀察到SiQDs在鹽濃度為0～100 mmol/L的范圍內熒光強度沒有明顯改變。比較在370 nm 激發光連續照射0～30 min以及保持溶液溫度分別為20、25、35、45 ℃的條件下SiQDs的熒光強度，發現SiQDs的熒光強度基本不變，以上說明所制備的SiQDs具有良好的穩定性和強的抗光漂白能力。

2.2 溶液酸度和反應時間的選擇

溶液酸度會影響量子點的發光性質，通常也會影響量子點與目標分析物之間的相互作用。圖3-a是在pH 3～12的測定體系中加入四環素后熒光猝滅效率(F0/F)隨pH變化的情況。可以看出，在所測試的pH范圍內，pH=7時猝滅最好。因此，實驗選擇在pH 7的B-R緩沖液中進行測定。圖3-b是在pH為7的熒光測定體系中加入四環素分別反應0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30 min后測定的熒光強度，由圖可見，猝滅在1min內即可達到平衡，說明利用該方法能夠實現對四環素的快速檢測。

a-溶液酸度對體系熒光猝滅的影響;b-反應時間對體系熒光猝滅的影響圖3 實驗條件的選擇(cTET=6 μmol/L)Fig.3 Selection of experimental conditions

2.3 量子點對四環素的選擇性

2.4 樣品分析

2.4.1 工作曲線

按照1.2.2實驗方法，測定加入不同濃度四環素標準溶液后體系的熒光光譜，結果顯示：隨著四環素濃度的增加，體系熒光強度逐漸降低。四環素在0.05～90 μmol/L的濃度范圍內與體系相對熒光強度的對數lg(F0/F)呈良好線性關系，線性方程為lg(F0/F)=0.0118 4c+0.015 78，相關系數R2為0.999 4, 檢出限為18 nmol/L (3σ/k)，低于鮮乳中規定的四環素限量標準。對含有6.0 μmol/L四環素的熒光體系平行測定8次，相對標準偏差為2.7%，說明該方法具有良好的重現性，能滿足實際樣品中四環素分析要求。

2.4.2 樣品測定結果及回收率

在選定的實驗條件下，根據實驗方法測定生鮮牛奶中四環素的殘留量。結果表明，21份生鮮奶中均未檢出四環素，一定程度上說明該地區目前生鮮牛奶中四環素殘留風險較小。任取其中一份樣品進行加標回收率試驗，加標水平為75、100、200 μg/L，處理方法與樣品相同，每個濃度水平重復測定6次，測得3個濃度水平的加標回收率為92.36%～104.07 %，相對標準偏差(RSD)為2.1%～4.2%(表1)，表明所建立的方法準確可靠，可用于實際乳樣分析。

表1 四環素在生鮮奶中的回收率(n=6)Table 1 Recoveries of TET in fresh milksamples(n=6)

注：ND代表低于檢測限

2.5 猝滅機理

從圖4可以看出，SiQDs 的激發光譜在300～450 nm的波長范圍內(曲線a)，四環素在此范圍內有吸收，吸收峰位于355 nm(曲線b)，二者間有相當程度的光譜重疊，滿足發生熒光內濾的條件，可以推斷猝滅機理主要是內濾效應。因此，當體系中加入四環素后，作為熒光體的SiQDs的激發光能量被熒光受體四環素有效吸收，導致體系熒光強度降低。

圖4 SiQDs 的熒光光譜(曲線a)和四環素的UV-vis吸收光譜圖(曲線b)Fig.4 Fluorescence spectra of SiQDs (curve a)andUV-Vis absorption spectra of TET(curve b)

由圖5可知，四環素在274 nm 和355 nm各有一個吸收峰，當與SiQDs 相互作用后，274 nm的峰消失，355 nm的峰以及SiQDs 352 nm 的吸收峰發生紅移，說明四環素分子與SiQDs中的羧基或氨基通過氫鍵作用形成了基態復合物，猝滅過程應為靜態猝滅。因為動態猝滅只影響熒光分子的激發態，而不改變熒光物質的吸收光譜[24]。

圖5 SiQDs、TET以及混合溶液的UV-vis吸收光譜Fig.5 UV-vis absorption spectra of the SiQDs，TET andthe mixture of the SiQDs and TET

進一步通過測量加入四環素前后SiQDs 的熒光壽命進行確定，發現加入四環素后SiQDs 的熒光壽命幾乎沒有改變(圖6)，說明猝滅為靜態猝滅[25]。因此，可以認為四環素對 SiQDs 的熒光猝滅主要為內過濾效應和靜態猝滅協同作用的結果。

圖6 加入TET前后SiQDs 的時間分辨衰減曲線Fig.6 Time-resolved decay curves of SiQDs in theabsence and presence of TET

3 結論

本文通過水熱法一步合成了水溶性的熒光硅量子點，合成方法簡單，避免了耗時的表面修飾過程，所合成的 SiQDs 具有良好的熱穩定性、優異的耐鹽性和抗光漂白能力。利用四環素與SiQDs之間存在內過濾效應和靜態猝滅的協同作用構建了新型熒光傳感器用于鮮奶中四環素測定，方法快速、靈敏、準確，并且不需要昂貴的設備，為鮮奶中四環素殘留檢測提供了一種新思路。