用于五種動物源性成分快速檢測的離心式微流控芯片系統研制

周新麗，申炳陽，高麗娟，孔兵，葉嘉明,3*

1(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093) 2(浙江清華長三角研究院 分析測試中心，浙江 嘉興，314006)3(國家食品安全風險評估中心 應用技術合作中心，浙江 嘉興，314006)

近年來，廉價肉冒充牛羊肉、掛鵝頭賣鴨肉等肉類及肉制品以次充好事件不斷發生，嚴重損害了消費者的權益。摻假肉類及肉制品不僅擾亂了正常的市場秩序，而且存在導致特殊體質人群發生過敏反應的潛在危險，對社會誠信、人們身心健康造成了極大的困擾[1-3]。針對日益繁多的肉類及肉制品摻假現象，如何建立快速、準確有效的動物源性成分檢測方法，已經成為肉類及肉制品安全領域的研究熱點。

目前，用于動物源性成分的檢測方法主要有常規理化檢驗技術、基于蛋白質的免疫分析技術和基于核酸的分子生物學技術[4-8]。其中，分子生物學技術中的重組酶介導擴增(recombinase-aid amplification, RAA)技術，以其操作簡單、恒溫條件下擴增、檢測時間短、靈敏度高等特點[9-11]，成為動物源性成分快速檢測最有效的方法之一，但是核酸檢測一般都存在環境中核酸污染的問題，氣溶膠的擴散容易造成后續樣本檢測出現假陽性。相比之下，使用微流控技術能夠很好地解決污染問題[12]，微流控芯片中環境的封閉性，使得外界核酸難以進入芯片內污染，而芯片內各腔室的獨立分布有效地隔斷了內部污染情況，將核酸污染降低到了最低程度；同時微流控芯片技術還具有試劑消耗量低、分析速度快、檢測通量高、設備體積小、自動化程度高、非專業人員使用、成本低等優點[13-15]，特別適合于動物源性成分的快速檢測。

本文將離心式微流控芯片和RAA技術相結合，使用一次性的高聚物微流控芯片，配合便攜式微流控速測儀，用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分的快速檢測，并設計了一套密封蓋片和芯片托盤裝置，旨在實現動物源性成分的多樣本、多指標快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芯片材料：光學級聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)板材，蘇州揚清芯片科技有限公司；光學級雙面膠(厚0.1 mm)，杭州霆科生物科技有限公司。

肉類樣品：豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉，購于杭州市蕭山區農貿超市。

試劑：豬源性成分分子檢測試劑盒、牛源性成分分子檢測試劑盒、羊源性成分分子檢測試劑盒、鴨源性成分分子檢測試劑盒、雞源性成分分子檢測試劑盒(包含引物、裂解液、緩沖液 A、緩沖液 B)，杭州眾測生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YoungLaser-V12型二氧化碳激光芯片雕刻機、蘇州揚清芯片科技有限公司；微流控芯片縫合機，蘇州揚清芯片科技有限公司；YQ-620C型超聲波清洗機，上海易凈超聲波儀器有限公司；DW系列超低溫保存箱(-86 ℃)，海爾生物醫療公司；Scientz-N型真空冷凍干燥機，寧波新芝生物技術股份有限公司；FA-1604電子天平，上海精科實業有限公司；Milli-Q超純水系統(18 MΩ)，美國Millipore公司；MF-52型倒置熒光顯微鏡，廣州明美光電技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 檢測原理

采用RAA技術來檢測分析動物源性成分。RAA技術原理[16]為在37 ℃恒溫下，重組酶和引物緊密結合成酶與引物的聚合體，當引物在模板DNA上搜索到同源序列時，單鏈DNA結合蛋白輔助打開DNA雙鏈結構，同時DNA聚合酶催化形成新的DNA互補鏈，擴增產物以指數級增長，并用熒光探針(熒光基團為FAM)標記目的基因進行實時熒光檢測，激發光波長為490 nm，檢測光波長為520 nm，擴增陽性的肉類樣品會產生“S”型擴增曲線，從而實現對肉類樣品的半定量檢測分析。

1.3.2 芯片的設計與制作

如圖1-a所示，設計的扇形微流控芯片由3層PMMA基片組成，蓋板、通道層、底板的厚度分別為0.5、2.0、0.5 mm。芯片主要由進樣孔、進樣區、儲液區、檢測區(同時包含陽性質控區、陰性質控區)、微通道、鋸齒形通道和通氣孔構成(圖1-b)，其中，進樣區、儲液區、檢測區的體積分別為140、20、20 μL。

a-立體結構;b-平面結構;1-進樣孔；2-進樣區；3-儲液區；4a-陽性質控區；4b-牛肉檢測區；4c-羊肉檢測區；4d-豬肉檢測區；4e-鴨肉檢測區；4f-雞肉檢測區；4g-陰性質控區；5-微通道；6-鋸齒形通道；7-通氣孔圖1 扇形微流控芯片結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of fan-shaped microfluidicchip structure

芯片的加工制作過程如下[17]：首先，用SolidWorks軟件設計微流控芯片的立體結構，通過結構分割劃分芯片為3層結構——底板、通道層、蓋板，并使用AutoCAD軟件繪制芯片各層的幾何圖案；其次，通過數據傳輸將設計好的芯片各層幾何圖案參數傳送至CO2激光雕刻機，采用CO2激光直寫法直接在PMMA基片上加工池體結構和微通道，形成通道層基片，同時切割獲得底板、蓋板基片；最后，將刻有微通道和池體結構的PMMA基片置于含去離子水的超聲波清洗機中清洗并吹干，之后與底板、蓋板基片使用雙面膠進行常溫鍵合，即得到一次性的PMMA微流控芯片。

1.3.3 密封蓋片及芯片托盤裝置的設計

為了避免環境中的核酸分子進入扇形微流控芯片內影響檢測，本實驗設計了1套配合扇形微流控芯片使用的密封蓋片。如圖2-a所示，密封蓋片主要由壓蓋、卡扣和疏水透氣膜構成，其中，疏水透氣膜只允許芯片與外界進行通氣，但不允許溶液通過。

如圖2-b所示，芯片托盤裝置上集成了5個可拆卸的扇形微流控芯片，檢測時可以自由選擇所放置扇形微流控芯片的個數，每次可同時檢測5個樣本，每個樣本可同時檢測5種指標，適用于動物源性成分的多樣本、多指標檢測。

a-密封蓋片;b-芯片托盤裝置;1-壓蓋；2-卡扣；3-疏水透氣膜圖2 密封蓋片及芯片托盤裝置Fig.2 Sealing cover and chip tray

1.3.4 芯片上的試劑預存儲

扇形微流控芯片鍵合之前，采用真空冷凍干燥法將所需試劑預先固定在芯片檢測區中[18]，具體操作方法如下：在圖1-b所示芯片的檢測區4b～4f中依次加入20 μL豬引物、牛引物、羊引物、鴨引物、雞引物溶液，分別用于豬肉、牛肉、羊肉、鴨肉、雞肉中肉源性成分的快速檢測；同時，在陽性質控區4a、陰性質控區4 g中分別加入20 μL陽性質控試劑(含引物及其模板DNA片段)和超純水，各自作為實驗的陽性質控和陰性質控。質控僅作為芯片上判讀結果是否有效的參考，不計入后面核酸擴增曲線研究。將加入試劑的芯片在超低溫保存箱-80 ℃下預凍30 min，之后置于真空冷凍干燥機內進行冷凍干燥2 h，獲得預存儲試劑的微流控芯片。

1.3.5 便攜式微流控速測儀的搭建

便攜式微流控速測儀如圖3-a所示，其基本組成包括恒溫控制平臺、流體控制模塊、光電檢測模塊和數據處理模塊等(3-b)。其中，流體控制模塊包括電機和芯軸；光電檢測模塊由LED光源、濾光片組和光電池感應器組成。便攜式微流控速測儀的運行過程如下：首先，流體控制模塊驅動電機并帶動微流控芯片沿中心位置轉動，一定時間后轉動停止；其次，微流控芯片在恒溫控制平臺的作用下逐漸達到設定溫度；最后，LED光源將會與芯片上特定的檢測區對準，檢測區的熒光基團經激發后射出一定波長的檢測光，通過光電池感應器讀取信號，再經過數據處理模塊，得到檢測區的熒光強度。

a-速測儀外觀圖;b-速測儀系統組成示意圖;1-微流控芯片；2-恒溫控制平臺；3-芯軸；4-電機；5-濾光片組；6-LED光源；7-光電池感應器圖3 便攜式微流控速測儀Fig.3 Portable microfluidic tachymeter

1.3.6 芯片上的流體控制

微流控芯片的基本特征是集成多種操作單元于整體可控的微小平臺上，進而實現微量液體在芯片內部的精密、可控轉移[19]。圖4顯示了扇形微流控芯片上的流體驅動過程。首先，用移液槍將待檢液加入進樣區(步驟1)；其次，待檢液等量分成7份轉移至儲液區(步驟2)；最后，儲液區的待檢液進入檢測區，進行核酸擴增及實時熒光檢測(步驟3)，從而完成芯片上的流體驅動過程。

1.3.7 離心式微流控芯片系統的考察

1.3.7.1 試劑準備

模板DNA的提取：稱取肉類樣品50～100 mg，剪碎，置于含有裂解液500 μL的1.5 mL離心管中，上下顛倒混勻，70 ℃下加熱10 min，待冷卻后12 000 r/min離心2 min，吸取上清液作為模板DNA，提取的模板DNA作為質量分數100%的源性成分DNA。

圖4 扇形微流控芯片上的流體驅動過程Fig.4 Fluid-driven process onfan-shaped microfluidic chips

反應液的制備：微流控芯片設計的進樣體積是140 μL，取5.6 μL模板DNA于0.5 mL離心管中，先后加入127.4 μL緩沖液A、7 μL緩沖液 B，渦旋，離心，靜置待用。

1.3.7.2 靈敏度實驗

將不同肉類樣品提取的模板DNA進行10倍梯度稀釋，設計5個稀釋度，用超純水分別配制質量分數為100%、10%、1%、0.1%、0.01%的豬、牛、羊、鴨、雞源性DNA進行實驗考察，以對應梯度稀釋的DNA為模板制備反應液。取140 μL反應液加入芯片進樣區，將扇形微流控芯片配合托盤裝置放入便攜式微流控速測儀內，每1 min采集1次動物源性成分檢測區的熒光值，以反應時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制5種動物源性成分的核酸擴增曲線。若動物源性成分對應檢測區的核酸擴增曲線為直線或不規則的“S”型曲線，結果判讀為陰性；若核酸擴增曲線為規則的“S”型曲線，結果判讀為陽性。以產生“S”形擴增曲線的最小質量分數作為該動物源性成分的檢出限，將擴增結束后的扇形微流控芯片置于熒光顯微鏡下判讀結果，檢測區有綠色熒光的為陽性，檢測區無綠色熒光的為陰性，并與核酸擴增曲線的分析結果進行比較。

1.3.7.3 特異性實驗

為了最大程度考察方法的特異性，對質量分數100%的豬、牛、羊、鴨、雞源性DNA進行單獨考察。取140 μL反應液加入芯片進樣區，將扇形微流控芯片配合托盤裝置放入便攜式微流控速測儀內，每1 min采集1次動物源性成分檢測區的熒光值，以反應時間為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制5種動物源性成分的核酸擴增曲線。在一定時間內，考察的具體源性成分只出現1條“S”型核酸擴增曲線，且“S”型核酸擴增曲線來自于源性成分對應檢測區，而其他檢測區的核酸擴增曲線為直線或不規則的“S”型曲線，則說明該源性成分的特異性良好，無交叉反應；若核酸擴增曲線未呈現上述特征，則說明該源性成分的特異性較差，存在交叉反應。

2 結果與分析

2.1 芯片上的流體控制

如圖5-A所示，芯片上定量加樣140 μL時，待檢液充滿整個進樣區；當流體控制模塊處于低速(介于500～700 r/min，逆時針)運行狀態時，待檢液等量分成7份轉移至儲液區，但無法突破儲液區和檢測區之間的“毛細管閥”作用(圖5-b)；當流體控制模塊處于高速(大于1 800 r/min，逆時針)運行狀態時，儲液區的待檢液將完全突破“毛細管閥”作用，進入并充滿檢測區(圖5-c)。確定微流控芯片上的流體控制參數為：一次離心轉速600 r/min，二次離心轉速1 900 r/min。

a-加樣狀態;b-低速離心狀態;c-高速離心狀態圖5 不同下狀態下的微流控芯片Fig.5 Microfluidic chips under different states

2.2 靈敏度實驗

圖6顯示了微流控芯片中5種動物源性成分的靈敏度擴增曲線。在質量分數為100%、10%、1%、0.1%、0.01%的動物源性成分待檢液中，以產生“S”型擴增曲線的最小質量分數作為該動物源性成分的檢出限。

如圖6-a所示，根據實時熒光擴增曲線的特征，質量分數為100%、10%、1%的牛源性成分擴增曲線呈現“S”型，而質量分數為0.1%、0.01%的牛源性成分擴增曲線為直線，說明最低可檢出質量分數1%的牛源性成分。牛源性成分核酸擴增曲線的起峰時間在5～8 min、25 min時核酸擴增結束，表明離心式微流控芯片系統可以在25 min內實現牛源性成分的快速檢測。同理，如圖6-b，6-c，6-d，6-e所示，羊、豬、鴨、雞源性成分的檢出限分別為1%、0.1%、0.1%、1%，離心式微流控芯片系統可以在25 min內實現5種動物源性成分的快速檢測。

a-牛源性;b-羊源性;c-豬源性;d-鴨源性;e-雞源性圖6 微流控芯片中5種動物源性成分的靈敏度擴增曲線Fig.6 Sensitivity curves of five animal derived components in microfluidic chips

為了確認離心式微流控芯片系統檢測的準確性，將擴增結束的微流控芯片置于熒光顯微鏡下進行觀察。根據檢測區是否有綠色熒光判讀結果，牛、羊、豬、鴨、雞源性成分的檢出限分別為1%、1%、0.1%、0.1%、1%，與便攜式微流控速測儀檢測的結果一致，這表明離心式微流控芯片系統的準確度較高。

2.3 特異性實驗

圖7顯示了微流控芯片中5種動物源性成分的特異性擴增曲線。如圖7-a所示，根據實時熒光擴增曲線的特征，在30 min內，考察的牛源性成分只出現1條“S”型核酸擴增曲線，且該“S”型核酸擴增曲線來自于牛肉檢測區，而羊、豬、鴨、雞肉檢測區的核酸擴增曲線為直線，則說明微流控芯片對牛源性成分檢測的特異性良好，無交叉反應；同理，如圖7-b～7-e所示，考察的羊、豬、鴨、雞源性成分均符合特異性良好的規定。綜上所述，微流控芯片方法的特異性良好，可以用來進行5種動物源性成分的同時檢測。

a-牛源性;b-羊源性;c-豬源性;d-鴨源性;e-雞源性圖7 微流控芯片中5種動物源性成分的特異性擴增曲線Fig.7 Specificity curves of five animal derived components in microfluidic chips

2.4 方法對比

將一些商品化的核酸擴增檢測儀與本文提出的離心式微流控芯片系統進行對比。從表1可以看出，離心式微流控芯片系統的反應條件簡單，能在37 ℃恒溫下快速擴增目的基因；污染少，微流控芯片中環境的封閉性使得外界核酸難以進入芯片內污染，而芯片內各腔室的獨立分布有效地隔斷了內部污染情況；檢測效率高，每次可同時檢測5個樣本，每個樣本可同時檢測5種指標；分析速度快，一般的核酸快速檢測時間為1 h及以上，而離心式微流控芯片系統的檢測時間僅為30 min。

表1 微流控芯片系統與商品化核酸擴增儀的對比Table 1 Comparison of microfluidic chip system and commercial nucleic acid amplification instrument

3 結論

本文基于RAA技術檢測原理，設計了用于牛、羊、豬、鴨、雞源性成分快速檢測的扇形微流控芯片和配套使用的密封蓋片、芯片托盤裝置。同時，搭建了芯片配套使用的便攜式微流控速測儀，其基本組成包括恒溫控制平臺、流體控制模塊和光電檢測模塊等。扇形微流控芯片經便攜式微流控速測儀的流體驅動測試后，得到了流體的控制參數：一次離心轉速600 r/min，二次離心轉速1 900 r/min。之后采用真空冷凍干燥技術，在微流控芯片上預存儲牛、羊、豬、鴨、雞的引物試劑，獲得了預存儲試劑的微流控芯片。對離心式微流控芯片系統進行考察，建立了半定量檢測牛、羊、豬、鴨、雞源性成分的方法。確定了牛、羊、豬、鴨、雞源性成分的檢出限分別為1%、1%、0.1%、0.1%、1%，離心式微流控芯片系統可以在25 min內實現5種動物源性成分的快速檢測，檢測的特異性良好，無交叉反應。