利用ICP-MS/MS測(cè)定白酒中無(wú)機(jī)元素的主成分分析及聚類(lèi)分析

楊雯懿，郝婧，田佳于，黃建華，陳林*

1(中南大學(xué) 計(jì)算機(jī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙,410083) 2(湖南省中醫(yī)藥研究院，中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙,410013)

白酒是將富含淀粉的原料經(jīng)發(fā)酵后產(chǎn)生的酒精再通過(guò)蒸餾收集得到的高濃度蒸餾酒，是我國(guó)特有的酒精飲品。中國(guó)白酒與白蘭地、威士忌、伏特加、金酒、朗姆酒為享有盛譽(yù)的六大蒸餾酒，具有悠久的歷史和精湛的釀造技藝，是世界飲食文化的重要組成部分。白酒中的成分組成受原料種類(lèi)和來(lái)源、釀造工藝以及貯存環(huán)境的影響存在很大差異，雖然白酒的整體質(zhì)量由有機(jī)成分所確定[1-3]，但其所含的多種無(wú)機(jī)元素不僅與白酒的品質(zhì)密切相關(guān)，而且還會(huì)影響飲用者的身體健康[4-6]。有研究表明，白酒中的Cu具有催化氧化作用，含量過(guò)高會(huì)影響酒體的感官品質(zhì)[7]；Fe、Mn形成的配合物具有著色作用，會(huì)影響白酒的色澤[8]；Mg、Fe、Ba超量或失衡均會(huì)引起酒體渾濁甚至沉淀，從而影響白酒的穩(wěn)定性[9]；As、Pb等重金屬元素含量過(guò)高具有毒害作用，影響白酒的飲用安全[10]。因此，無(wú)機(jī)元素常用于白酒的質(zhì)量控制和安全性研究。

白酒中無(wú)機(jī)元素的含量分布離散，且與白酒的種類(lèi)密切相關(guān)，即使是相同元素在不同種類(lèi)的白酒中仍然存在較大的差異[11]。白酒中大部分無(wú)機(jī)元素的含量處于微量和痕量水平級(jí)別，這就要求分析方法的靈敏度高、檢出限低。在各種用于測(cè)定白酒中無(wú)機(jī)元素的原子光譜技術(shù)中，相比于傳統(tǒng)的原子吸收光譜(atomic absorption spectroscopy, AAS)和電感耦合等離子發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-atomic emission spectrum,ICP-OES)，電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS)應(yīng)用更廣泛[12-13]。然而，采用ICP-MS測(cè)定未經(jīng)消解的白酒中的痕量元素仍然具有挑戰(zhàn)性，由于低含量痕量元素產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度弱，會(huì)受到來(lái)自基質(zhì)元素產(chǎn)生的大量背景信號(hào)以及多原子離子的干擾，需要借助碰撞/反應(yīng)池(collision/reaction cell，CRC)技術(shù)來(lái)消除這些干擾。盡管帶CRC的ICP-MS減輕了分析挑戰(zhàn)的壓力，但依然不能消除一些棘手的質(zhì)譜干擾[14]。電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜(inductively coupled plasma tandem mass spectrometry，ICP-MS/MS)是在ICP-MS的ICP和CRC之間附加了一級(jí)四極桿質(zhì)量過(guò)濾器(the first quadrupole，Q1)，與位于CRC后端配置的二級(jí)四極桿質(zhì)量過(guò)濾器(the second quadrupole，Q2)組成串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry，MS/MS)，通過(guò)Q1和Q2的雙重過(guò)濾，可以將來(lái)自等離子體和樣品基質(zhì)的干擾離子阻止在檢測(cè)器外，極大提高消除干擾性能和分析靈敏度[15-18]。本研究采用體積分?jǐn)?shù)1%的硝酸稀釋白酒樣品，應(yīng)用ICP-MS/MS法測(cè)定其中Mg、Al、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Ba、Pb等14種無(wú)機(jī)元素，在MS/MS模式下分別選擇O2和NH3/He為反應(yīng)氣消除質(zhì)譜干擾，建立了白酒中多元素的ICP-MS/MS分析方法，采用SPSS主成分分析和聚類(lèi)分析法探討白酒特征元素和無(wú)機(jī)元素與白酒品種的關(guān)系，旨在為白酒中無(wú)機(jī)元素的分析提供科學(xué)方法，為白酒的品種識(shí)別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1 g/L的Mg、Al、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Ba、Pb單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；10 mg/L的Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi混合內(nèi)標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國(guó)Agilent公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%硝酸、無(wú)水乙醇，德國(guó)Merck公司；實(shí)驗(yàn)用水均為Milli超純水。18種白酒(產(chǎn)地分別為四川9種、貴州3種、重慶3種、湖南3種)，湖南長(zhǎng)沙各大超市。

1.2 儀器及工作參數(shù)

Agilent 8800型電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Agilent公司。Milli-Q超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

ICP-MS/MS的工作參數(shù)：射頻功率1 550 W；等離子模式低基質(zhì)；等離子氣流速15.0 L/min；載氣流速1.09 L/min；輔助氣流速1.8 L/min；補(bǔ)償氣流速0.2 L/min；采樣深度8.0 mm；霧室溫度2 ℃；質(zhì)譜分析模式MS/MS；CRC氣體O2、NH3/He(1∶9，V/V)；反應(yīng)氣O2流速0.40 mL/min；反應(yīng)氣NH3/He流速3.0 mL/min；八極桿偏置電壓-15 V(O2)、-20 V(NH3/He)；KED偏置電壓-10 V(O2)、-10 V(NH3/He)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用體積分?jǐn)?shù)1%的硝酸對(duì)白酒樣品進(jìn)行10倍稀釋后直接進(jìn)樣，在選擇的工作條件下利用ICP-MS/MS進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)內(nèi)標(biāo)混合T型接頭在所有上機(jī)測(cè)試品中均在線加入1 mg/L的Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi混合內(nèi)標(biāo)元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，所有空白溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液均加入5%vol的乙醇溶液以匹配樣品基體消除黏度差別，校正基體效應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

配制分析元素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用ICP-MS/MS的MassHunter工作站軟件(美國(guó)Agilent公司)繪制校準(zhǔn)曲線，通過(guò)校準(zhǔn)曲線計(jì)算18個(gè)樣品中14種無(wú)機(jī)元素的含量，組成18×14的原始數(shù)據(jù)分析矩陣，應(yīng)用SPSS 25軟件進(jìn)行主成分分析和聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ICP-MS/MS分析

ICP-MS/MS在單四極桿(single quad, SQ)模式下，Q1僅具有離子導(dǎo)入或離子帶通功能，類(lèi)似于傳統(tǒng)的ICP-MS，對(duì)于無(wú)干擾或受到輕微干擾元素的測(cè)定，在SQ標(biāo)準(zhǔn)模式(CRC中無(wú)反應(yīng)氣)下的靈敏度比MS/MS模式高，本實(shí)驗(yàn)樣品中Sr、Ba、Pb受到的干擾比較輕微可忽略不計(jì)，采用SQ標(biāo)準(zhǔn)模式進(jìn)行測(cè)定。在MS/MS模式下，Q1具有質(zhì)量過(guò)濾功能，僅允許與分析離子具有相同質(zhì)荷比(m/z)的離子進(jìn)入CRC，在CRC內(nèi)通過(guò)反應(yīng)氣的選擇，確保CRC中反應(yīng)過(guò)程和生成產(chǎn)物的一致性，利用分析離子或干擾離子與反應(yīng)氣反應(yīng)產(chǎn)生的m/z差異，通過(guò)Q2對(duì)來(lái)自CRC的離子再次過(guò)濾消除干擾。本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS/MS分析白酒中無(wú)機(jī)元素的工作原理見(jiàn)圖1。

圖1 在MS/MS模式下消除干擾的工作原理Fig.1 The working mechanism of interferences eliminatingin the MS/MS mode

2.1.1 質(zhì)譜干擾的消除

表1 待測(cè)元素的質(zhì)譜分析模式Table 1 Mass spectrometry analysis modes of analytes

2.1.2 內(nèi)標(biāo)元素的選擇

樣品溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的基質(zhì)組成差異表現(xiàn)為溶液的進(jìn)樣速率和霧化效率不同，形成基體效應(yīng)，影響分析信號(hào)的穩(wěn)定性，通常采用內(nèi)標(biāo)元素為參照物進(jìn)行校正[21]。考察了Li、Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi為內(nèi)標(biāo)元素，在待測(cè)樣品中加入5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)測(cè)定各元素的加標(biāo)回收率來(lái)選擇內(nèi)標(biāo)元素。從圖2可以看出，Sc作內(nèi)標(biāo)元素時(shí)，Mg、Al、Cr、Mn、Fe的加標(biāo)回收率高于其他內(nèi)標(biāo)元素；Ge作內(nèi)標(biāo)元素時(shí)，Co、Ni、Cu、Zn的加標(biāo)回收率最高；Y作內(nèi)標(biāo)元素時(shí)，As、Se、Sr的加標(biāo)回收率最高；In和Bi作內(nèi)標(biāo)元素時(shí)，Ba和Pb的加標(biāo)回收效果最高。因此，本實(shí)驗(yàn)Sc為Mg、Al、Cr、Mn、Fe的內(nèi)標(biāo)元素，Ge為Co、Ni、Cu、Zn的內(nèi)標(biāo)元素，Y為As、Se、Sr的內(nèi)標(biāo)元素，In為Ba的內(nèi)標(biāo)元素，Bi為Pb的內(nèi)標(biāo)元素。

圖2 內(nèi)標(biāo)元素的校正效果Fig.2 Correction effect of internal standard elements

2.1.3 校準(zhǔn)曲線與檢出限

分別配制0、1.0、5.0、20.0、100 μg/L的Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Ba、Pb和0、5、20、100、500 μg/L的Mg、Al、Fe、Zn混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按所建立的分析方法上機(jī)測(cè)定后繪制校準(zhǔn)曲線。連續(xù)測(cè)定空白溶液11次，以各元素測(cè)定結(jié)果的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度為各元素的檢出限，以測(cè)定結(jié)果的10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的濃度為各元素的定量限。結(jié)果表明(表2)，14個(gè)分析元素在各自范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)≥0.999 7，檢出限為1.34～25.8 ng/L，定量限為4.47～86.0 ng/L，說(shuō)明方法的線性關(guān)系好，檢出限低。

表2 分析元素的校準(zhǔn)數(shù)據(jù)、檢出限和定量限Table 2 Calibration data, limits of detection (LODs), and limits of quantification (LOQs) of analytes

采用所建立的ICP-MS/MS法對(duì)實(shí)際白酒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每10 min測(cè)定1次，每個(gè)元素重復(fù)測(cè)定6次，通過(guò)計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)來(lái)考察分析方法的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和精密度。從表3可以看出，各元素的加標(biāo)回收率為93.0%～105%，表明方法的準(zhǔn)確度好；RSD≤3.84%，表明方法的穩(wěn)定性好，精密度好。

表3 分析方法的準(zhǔn)確度與精密度Table 3 Accuracy and precision of analytical method

2.1.4 白酒中無(wú)機(jī)元素的含量

實(shí)驗(yàn)收集了國(guó)內(nèi)18種白酒，其中來(lái)自四川9種(樣品編號(hào)SC1-9)、貴州3種(樣品編號(hào)GZ1-3)、重慶3種(樣品編號(hào)CQ1-3)、湖南3種(樣品編號(hào)HN1-3)，測(cè)定各白酒中的14種無(wú)機(jī)元素，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見(jiàn)表4。18種白酒中Mg、Al、Fe的含量相對(duì)較高，而Co的含量最低，四川白酒中Mg的含量明顯低于其他產(chǎn)地白酒，湖南白酒中的Al和Fe的含量明顯高于其他產(chǎn)地白酒；對(duì)照我國(guó)白酒國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2757—2012、GB 23545—2009GB 以及食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)2762—2017所規(guī)定的限量值[10, 22-23]，所有白酒中的重金屬元素Mn、Ni、As、Pb的含量處于較低水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的限量值。表4結(jié)果顯示不同產(chǎn)地白酒中無(wú)機(jī)元素的含量存在明顯差異。

表4 不同白酒樣品分析結(jié)果 單位：μg/L

2.2 主成分分析

主成分分析是將多個(gè)原始變量抽取和壓縮成能代表原始變量大量信息的少數(shù)綜合指標(biāo)[24]，本實(shí)驗(yàn)采用SPSS 25對(duì)國(guó)內(nèi)18種白酒中的14種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行主成分分析。

2.2.1 無(wú)機(jī)元素的正態(tài)分布檢驗(yàn)

采用SPSS 25的正態(tài)性檢驗(yàn)對(duì)18種白酒中的14種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行K-S檢驗(yàn)，Mg、Al、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Ba、Pb的顯著性(雙側(cè))P值分別為0.230、0.364、0.208、0.278、0.236、0.137、0.105、0.231、0.288、0153、0.182、0.171、0.138、0.133，均大于顯著水平(α=0.05)，表明18種白酒中的14種無(wú)機(jī)元素的含量數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布。

2.2.2 無(wú)機(jī)元素的相關(guān)性分析

表5可以看出，14種元素兩兩之間大部分處于顯著相關(guān)，少數(shù)處于極顯著相關(guān)，因此，主成分分析可用于14種無(wú)機(jī)元素的相關(guān)性分析。

表5 白酒中無(wú)機(jī)元素的相關(guān)性矩陣Table 5 Correlation matrix of inorganic elements in Baijiu

續(xù)表5

無(wú)機(jī)元素MgAlCrMnFeCoNiCuZnAsSeSrBaPbZn-0.538-0.3500.102-0.352-0.351-0.4200.039-0.3791.000As0.1930.518-0.041-0.0210.6040.2600.0080.451-0.3981.000Se0.1020.568-0.214-0.1890.6140.3790.5260.230-0.4290.3741.000Sr-0.706-0.1400.538-0.230-0.2980.2230.0620.0240.123-0.1020.0211.000Ba-0.095-0.0570.5430.122-0.1050.4860.0870.462-0.3920.1340.1310.2291.000Pb0.3110.457-0.230-0.4750.381-0.1880.096-0.2250.215-0.0890.174-0.046-0.2691.000

2.2.3 無(wú)機(jī)元素的因子分析

采用主成分分析法提取公因子，進(jìn)行因子分析，結(jié)果見(jiàn)表6。基于累積方差貢獻(xiàn)值大于80%且特征值大于1為原則，選擇公因子數(shù)為5個(gè)時(shí)，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為80.003%，包含了14種無(wú)機(jī)元素的大部分信息，因此，本實(shí)驗(yàn)提取5個(gè)主成分來(lái)評(píng)判18種白酒中無(wú)機(jī)元素的分布。

表6 主成分分析特征值和總體方差描述Table 6 Principal component analysis characteristicsand total variance explained

通過(guò)表7可以得到第一主成分F1、第二主成分F2、第三主成分F3、第四主成分F4、第五主成分F5的因子得分模型，分別為：

F1=0.661X1+0.884X2-0.321X3+0.026X4+0.927X5+0.494X6+0.335X7+0.171X8-0.611X9+0.624X10+0.709X11-0.339X12+0.075X13+0.282X14

F2=-0.410X1-0.070X2+0.689X3+0.117X4-0.124X5+0.501X6+0.132X7+0.573X8-0.378X9+0.279X10+0.201X11+0.538X12+0.814X13-0.534X14

F3=-0.470X1+0.232X2+0.194X3-0.741X4+0.169X5+0.127X6+0.467X7-0.191X8+0.489X9-0.085X10+0.344X11+0.545X12-0.117X13+0.519X14

F4=0.068X1+0.041X2-0.077X3+0.389X4-0.064X5+0.534X6+0.372X7-0.662X8-0.038X9-0.455X10+0.013X11+0.092X12+0.063X13-0.190X14

F5=0.243X1+0.254X2+0.361X3-0.068X4+0.086X5+0.213X6-0.533X7-0.226X8-0.036X9-0.021X10-0.413X11+0.180X12+0.174X13+0.345X14

可以看出，F(xiàn)1在X2、X5有較大荷載值，與對(duì)應(yīng)的Al、Fe有高度正相關(guān)性，F(xiàn)2在X13有較大荷載值，與對(duì)應(yīng)的Ba有高度正相關(guān)性，由于F1和F2對(duì)總方差的貢獻(xiàn)達(dá)到了48.632%，因此，所對(duì)應(yīng)的Al、Fe、Ba可作為本實(shí)驗(yàn)18種白酒的特征元素。

表7 白酒中無(wú)機(jī)元素的因子分析Table 7 Factor analysis of inorganic elements in Baijiu

2.3 聚類(lèi)分析

采用SPSS 25對(duì)來(lái)自不同產(chǎn)地的18種白酒樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，把性質(zhì)相近的白酒歸為一類(lèi)。將14種原始變量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用系統(tǒng)聚類(lèi)分析，選擇組間連接聚類(lèi)，以歐氏距離平方為測(cè)量準(zhǔn)則，從圖3可以看出，18種白酒樣品分為了4類(lèi)，表明不同產(chǎn)地白酒之間無(wú)機(jī)元素的含量存在較大差異，其中四川9種白酒很好地歸為了一類(lèi)，貴州的3種白酒歸為一類(lèi)，重慶的3種白酒歸為一類(lèi)，湖南3種白酒歸為一類(lèi)，表明以14種元素為原始變量可以將不同產(chǎn)地白酒進(jìn)行正確歸類(lèi)。

圖3 白酒中無(wú)機(jī)元素含量系統(tǒng)聚類(lèi)Fig.3 Phylogenetic clustering of distilled Baijiu basedon inorganic elements

3 結(jié)論

該文研究了不同產(chǎn)地白酒中14種無(wú)機(jī)元素的組成。白酒樣品經(jīng)1%的硝酸簡(jiǎn)單稀釋后直接采用ICP-MS/MS法進(jìn)行測(cè)定，在MS/MS模式下，分別采用O2和NH3/He為反應(yīng)氣，利用質(zhì)量轉(zhuǎn)移法和原位質(zhì)量法消除了質(zhì)譜干擾。采用SPSS 25對(duì)18種白酒樣品中的14種無(wú)機(jī)元素進(jìn)行了主成分和聚類(lèi)分析，提取了5個(gè)主成分來(lái)評(píng)判白酒中無(wú)機(jī)元素的分布，確定了Al、Fe、Ba為國(guó)內(nèi)18種白酒的特征元素，聚類(lèi)分析將國(guó)內(nèi)18種白酒樣品很好地按產(chǎn)地分為4類(lèi)，白酒中無(wú)機(jī)元素的含量存在明顯差異且具有典型的地理特征。