四川傳統(tǒng)臘肉中微生物群落結(jié)構(gòu)研究

文開勇，汪月，文鵬程，朱艷，楊敏，張忠明，張衛(wèi)兵*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)

四川臘肉是以屠宰后的鮮豬肉為主要原料，用食鹽等腌制后，經(jīng)烘烤、煙熏而成的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品，因其獨(dú)有的風(fēng)味、鮮明的色澤和濃郁的香氣，受到廣大人民的喜愛[1-3]。在制作與貯藏過程中，微生物作用于臘肉中的蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，形成了臘肉良好的色澤和風(fēng)味[4-5]。由于臘肉加工環(huán)境相對開放，多種微生物參與了臘肉的成熟過程。

目前關(guān)于臘肉中微生物的報道較多。全拓等[6]研究川味臘肉貨架期間的主要微生物，得出優(yōu)勢菌是葡萄球菌和微球菌，其次是乳酸菌；劉有晴等[7]采用可培養(yǎng)方法，對農(nóng)家自制四川臘肉中乳酸菌進(jìn)行分離篩選，獲得1株植物乳桿菌；于華等[8]以四川臘肉為研究對象，采用平皿生化法對其高產(chǎn)脂肪酶的霉菌進(jìn)行分離篩選，獲得1株團(tuán)青霉(Penicilliumcommune)；田園園等[9]從四川省眉山等5市的傳統(tǒng)腌臘肉樣品中篩選出8株乳酸菌；陳競適等[10]以湘西花垣縣和鳳凰縣農(nóng)戶陳年臘肉為原料，研究得出酵母菌、霉菌和微球菌是其主要微生物群落；馮秀娟等[11]研究了湖南懷化地區(qū)傳統(tǒng)臘肉，得出優(yōu)勢菌為乳酸菌和葡萄球菌；李福榮等[12]對信陽傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中的細(xì)菌進(jìn)行研究，得出優(yōu)勢菌為葡萄球菌和微球菌；畢旺來等[13]對湖北省神農(nóng)架林區(qū)的臘肉進(jìn)行研究，得出主要微生物為葡萄球菌。不同地區(qū)臘肉的微生物多樣性存在差異，以上研究均以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為基礎(chǔ)的微生物學(xué)手段進(jìn)行分析，該方法的缺陷是不能全面、準(zhǔn)確地反映樣品的微生物信息[14]；新興的Illumina高通量測序技術(shù)具有操作簡單、成本較低、結(jié)果可信度高等優(yōu)勢[15]。因此，通過Illumina高通量測序技術(shù)能夠全面而準(zhǔn)確地了解研究對象中微生物種類組成和結(jié)構(gòu)。

本研究運(yùn)用Illumina高通量測序技術(shù)對采自四川省達(dá)州市的臘肉樣品中微生物多樣性進(jìn)行分析，以期全面地解析臘肉中的微生物組成及群落結(jié)構(gòu)，為四川傳統(tǒng)臘肉的加工及品質(zhì)控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E.Z.N.A.Soil DNA kit D5626-01試劑盒，美國OMEGA公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒，美國Invitrogen公司；Q5高保真DNA聚合酶，美國New England Biolabs公司；凝膠回收試劑盒，美國AXYGEN公司；TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21型臺式離心機(jī)，Thermo Fisher；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司；Q32866型Qubit 2.0分光光度計，Invitrogen公司；T100TM Thermal Cyeler型PCR儀，BIO-RAD公司；MiSeq System SY-410-1003高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品的采集

2019年3月于四川省達(dá)州地區(qū)采集6份臘肉樣品(編號分別為M1、M2、M3、M4、M5、M6)，將所有樣品裝入自封袋，置于冷藏箱中運(yùn)至實驗室以備試驗。

1.3.2 臘肉微生物總DNA的提取

臘肉樣品中微生物總DNA提取選用E.Z.N.A.Soil DNA Kit D5625-01試劑盒，按照使用說明從樣品中提取DNA；然后使用 Qubit 2.0 分光光度計定量提取的 DNA，并通過 0.8%瓊脂糖凝膠電泳確定 DNA 提取的完整性。

1.3.3 PCR擴(kuò)增及測序

以稀釋后的基因組總 DNA 為模板，靶向擴(kuò)增 16S rRNA的 V3-V4區(qū)，擴(kuò)增引物分別為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3′)。選用真菌特異性引物對ITS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物分別為ITS5F(GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG)和ITS1R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR條件如下：預(yù)變性為95 ℃、5 min，然后95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共25個循環(huán)，72 ℃退火10 min，最后保存在4 ℃條件下。選用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，然后用試劑盒回收并進(jìn)行質(zhì)量檢測并建庫。最后由上海派森諾生物科技股份有限公司在MiSeq測序平臺進(jìn)行雙端測序。

1.3.4 高通量測序數(shù)據(jù)處理

MiSeq測序得到的數(shù)據(jù)選用Mothur(V.1.31.2)和QIIME(V.1.7.0)軟件進(jìn)行處理及分析[16-17]。首先選用滑動窗口法對FASTQ格式的雙端序列逐一進(jìn)行質(zhì)量篩選，然后利用FLASH軟件(v1.2.7)對質(zhì)量初篩的雙端序列進(jìn)行配對連接,最后將連接后的序列識別分配對應(yīng)樣本，從而獲得有效序列。在測序過程中會產(chǎn)生一些錯誤或疑問序列，因此選用QIIME軟件(v1.8.0)[18]識別疑問序列。隨后調(diào)用USEARCH(v5.2.236)檢查并剔除嵌合體序列[19-22]。最后，調(diào)用UCLUST算法進(jìn)行序列聚類，以97%的序列相似度進(jìn)行歸并和(operational taxonomic units，OTU)[23]劃分。

采用Mothur(V.1.31.2)軟件進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的Alpha多樣性分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和Origin 2018軟件進(jìn)行處理分析并作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 四川傳統(tǒng)臘肉樣品中Alpha多樣性分析

臘肉樣品中細(xì)菌和真菌的測序結(jié)果及Alpha多樣性指數(shù)如表1所示。通過細(xì)菌16S rRNA 的V3-V4區(qū)進(jìn)行測序，6份樣品共產(chǎn)生高質(zhì)量序列190 673條，將所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，得到7014個OTU；通過真菌ITS區(qū)測序，6份樣品共產(chǎn)生高質(zhì)量序列213 533條，聚類后得到1 812個OTU。

表1 測序結(jié)果及Alpha多樣性指數(shù)表Table 1 Sequencing results and Alpha diversity index

注：表中M1-B到M6-B為樣品細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)，B-mean為細(xì)菌樣品的Alpha多樣性指數(shù)的平均值；M1-F到M6-F為細(xì)菌樣品的Alpha多樣性指數(shù)，F(xiàn)-mean為樣品真菌的Alpha多樣性指數(shù)的平均值

Shannon指數(shù)是衡量物種多樣性的指數(shù)，Shannon指數(shù)值越高，物種多樣性越豐富，反之,物種多樣性越少。6份樣品中細(xì)菌的Shannon指數(shù)在2.85～6.80之間，最高的為樣品M6-B(6.80)，表明M6-B中細(xì)菌OTU的多樣性較高；Shannon指數(shù)最低的為樣品M5-B(2.85)，反映了M5-B中細(xì)菌多樣性較低；6份樣品中真菌的Shannon指數(shù)在0.67～2.18之間，最高的為樣品M5-F(2.18)，表明M5-F真菌OTU的多樣性較高；Shannon指數(shù)最低的為樣品M4-F(0.67)，反映了M4-F的真菌多樣性較低。

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)主要體現(xiàn)稀有群落的豐富度。Chao1指數(shù)或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。6份樣品中細(xì)菌的Chao1指數(shù)在367.30～901.96之間，ACE指數(shù)在373.56～974.03之間；樣品M2-B的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高，分別為901.96和974.03，并且OUT數(shù)最多(1 862個)。6份樣品中真菌的Chao1指數(shù)在47.00～2 510.14之間，ACE指數(shù)在47.42～267.25之間；樣品M1-F的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)最高，分別為251.14和267.25，并且OUT數(shù)最多(410個)。

細(xì)菌樣品中OUT、Chao1、ACE、Shannon指數(shù)的平均值分別為1 169、552.24、573.18、5.06；真菌樣品中OUT、Chao1、ACE、Shannon指數(shù)的平均值分別為302、164.11、170.11、1.42。細(xì)菌的數(shù)值均高于真菌，表明細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)高于真菌。

稀疏曲線是評定每個樣品在當(dāng)前的測序深度下是否能反映該樣品中所包含的微生物群落多樣性的標(biāo)準(zhǔn)[24-26]。6份臘肉樣品中細(xì)菌和真菌的香農(nóng)指數(shù)稀疏曲線如圖1所示。由圖1可以看出，6份臘肉樣品的香農(nóng)指數(shù)隨著測序量的增大呈現(xiàn)上升趨勢，說明在此測序水平下，樣品中還有較多的物種沒有被檢測到；當(dāng)測序量較高時，香濃曲線逐漸與X軸接近平行，說明在此測序水平下，樣品中細(xì)菌和真菌的群落多樣性已得到充分的展現(xiàn)。

a-細(xì)菌；b-真菌圖1 細(xì)菌香濃指數(shù)稀疏曲線和真菌香濃指數(shù)稀疏曲線Fig.1 Sparse analysis diagram of bacterial index andsparse analysis of fungi Shannon index

2.2 四川傳統(tǒng)臘肉樣品中微生物群落在門水平的比較

表2為6份臘肉樣品從門分類水平進(jìn)行鑒定的結(jié)果。由表2可知，在臘肉樣品中檢測出5個細(xì)菌門，分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中，所有樣品中細(xì)菌的第一優(yōu)勢門均為厚壁菌門(相對豐度大于1%)，其豐度值在84.00%～99.86%之間，平均相對豐度為95.99%；變形菌門為樣品M1、M2、M5、M6的第二優(yōu)勢門；放線菌門、藍(lán)藻門和擬桿菌門平均豐度值均小于1%，為樣品中的非優(yōu)勢門。厚壁菌門和變形菌門也是風(fēng)干肉制品[27]、湖北省恩施臘肉[28]、傳統(tǒng)自然發(fā)酵酸肉[29]、4 ℃貯藏的冰鮮鴿肉[30]、發(fā)酵鰩魚[31]的優(yōu)勢門，這與本研究結(jié)果一致。

表2 各樣品門水平菌群分布相對豐度Table 2 The relative abundance of microbial floradistribution at phylum level in each sample

在6份臘肉樣品中檢測出4個真菌門，分別是為子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、羅茲菌門(Rozellomycota)；其中子囊菌門為共有優(yōu)勢門(相對豐度大于1%)，平均相對豐度為98.99%；擔(dān)子菌門為樣品M5的第二優(yōu)勢門，球囊菌門和羅茲菌門在樣品中的豐度都很低，為非優(yōu)勢門。有研究報道，子囊菌門也是發(fā)酵酸魚[32]、傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品[33]的優(yōu)勢門，這與本研究結(jié)果一致。

2.3 四川傳統(tǒng)臘肉樣品的微生物群落在屬水平的比較

表3為臘肉樣品中細(xì)菌屬水平的分類鑒定結(jié)果。由表3可以看出，葡萄球菌屬(Staphylococcus)豐度值在 63.30%～98.42%的范圍內(nèi)，平均豐度為88.43%，是所有樣品中的第一優(yōu)勢屬；巨球菌屬(Macrococcus)為M1、M2、M5臘肉樣品中的第二優(yōu)勢屬；不動桿菌屬(Acinetobacter)是M6樣品的第二優(yōu)勢屬，也是M2樣品的第三優(yōu)勢屬；嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、環(huán)絲菌屬(Brochothrix)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和腸桿菌屬(Enterobacter)平均豐度值在0.1%～0.2%之間，為樣品中的非優(yōu)勢屬；另外，樣品中還包含許多在屬水平上未鑒定的屬(Unclassified)，其豐度值在 0.34%～9.03%的范圍內(nèi)。在本研究中葡萄球菌屬為四川傳統(tǒng)臘肉的絕對優(yōu)勢屬，秦丹[34]以四川臘肉和香腸為研究對象，得出葡萄球菌是兩者的共同優(yōu)勢菌；陳美春等[1]、全拓等[6]運(yùn)用純培養(yǎng)法對四川臘肉的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)葡萄球菌是臘肉的優(yōu)勢菌；而LEE等[35]在發(fā)酵魚醬的研究中也發(fā)現(xiàn)葡萄球菌是其優(yōu)勢菌，與本研究結(jié)果相同。陳美春等[1]和全拓等[6]的研究還表明乳酸菌是四川臘肉的優(yōu)勢菌，而在本研究中檢測出的乳球菌屬和乳桿菌屬豐度較低，這可能與臘肉樣品的來源有關(guān)；與上述研究不同，本研究中發(fā)現(xiàn)巨球菌屬在樣品M1、M2、M5中的相對豐度大于1%，為優(yōu)勢屬。

表3 各樣品屬水平細(xì)菌的相對豐度Table 3 The relative abundance of bacterial flora atgenus level in each sample

續(xù)表3

屬分類細(xì)菌屬水平相對豐度/%M1M2M3M4M5M6Exiguobacterium 0.000.010.000.000.000.00Enhydrobacter 0.000.010.000.000.010.00Kurthia 0.000.040.000.000.010.00Ewingella 0.000.010.000.000.000.00Leuconostoc 0.000.000.000.000.010.00Amycolatopsis 0.000.010.000.000.000.00Pediococcus 0.030.000.000.000.020.01Trichococcus 0.000.000.000.000.010.00Corynebacterium 0.000.010.000.000.000.00Granulicatella 0.000.010.000.000.000.00Delftia 0.000.010.000.000.000.00Aeromicrobium 0.000.010.000.000.000.00Dermacoccus 0.000.010.000.000.000.00Luteococcus 0.000.010.000.000.000.00Agrobacterium 0.000.010.000.000.000.00Agrococcus 0.000.010.000.000.000.00Patulibacter 0.000.010.000.000.000.00Lysobacter 0.000.010.000.000.000.00Novosphingobium 0.000.010.000.000.000.00Moraxella 0.000.010.000.000.000.00Geodermatophilus 0.000.010.000.000.000.00未定義6.722.881.329.034.090.34

葡萄球菌可以抑制脂肪氧化，能分解肉制品中乳酸代謝產(chǎn)生的過氧化物，有利于形成風(fēng)味，改善色澤延緩酸敗以及提升產(chǎn)品質(zhì)安全性[36-37]。因此四川傳統(tǒng)臘肉中葡萄球菌的含量可能是顏色和風(fēng)味形成的主要因素[12]。

表4為臘肉樣品中真菌屬水平的分類鑒定結(jié)果。由表4可以看出，曲霉屬 (Aspergillus)豐度值在77.72%～98.42%之間，平均豐度值為88.46%，為臘肉樣品的第一優(yōu)勢屬；德巴利酵母屬(Debaryomyces)為樣品M1、M3、M4、M5、M6的第二優(yōu)勢屬；假絲酵母屬(Candida)為樣品M5的第三優(yōu)勢屬，但假絲酵母屬在所有樣品中的平均豐度較低；節(jié)菌屬(Wallemia)、青霉菌屬(Penicillium)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)和亞隔孢殼屬(Didymella)平均豐度值在0.1%～0.5%之間，為樣品的非優(yōu)勢屬；另外，樣品中還包含許多未鑒定的屬(Unclassified)，但豐度較低，其豐度值在 0.04%～1.90%的范圍內(nèi)。本研究中發(fā)現(xiàn)曲霉屬是四川傳統(tǒng)臘肉的優(yōu)勢屬，謝康莊等[38]采用純培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)曲霉菌是湘西臘肉中的優(yōu)勢菌，與本文研究結(jié)果相一致。

霉菌和酵母菌為臘肉中的優(yōu)勢菌可能是因為家庭自制過程中的缺陷和貯藏過程中粗放的環(huán)境有關(guān)，另外與臘肉的水分含量和濕潤氣候也有關(guān)系，導(dǎo)致霉菌大量增長[10]。霉菌和酵母菌在臘肉形成獨(dú)特的風(fēng)味和提升安全性方面發(fā)揮了重要作用。霉菌屬于好氧菌，往往存在于臘肉表面，能夠抑制有害菌生長并且使臘肉具有特殊的香氣，添加適量霉菌，還能夠延長肉制品的保質(zhì)期，有利于產(chǎn)品的儲存。酵母菌屬于兼性菌，在發(fā)酵時可吸收掉殘存氧氣從而能夠抑制臘肉氧化酸敗，還能阻止有害微生物的滋生，另外對臘肉風(fēng)味的形成有促進(jìn)作用[39-41]。

表4 各樣品屬水平真菌的相對豐度Table 4 The relative abundance of fungi flora at genuslevel in each sample

續(xù)表4

2.4 四川傳統(tǒng)臘肉樣品中微生物的主成分分析

在圖2中，樣品間距遠(yuǎn)近表示了其差異性大小，2點之間的距離越近，表明2個樣本之間的微生物群落結(jié)構(gòu)相似度越高，差異越小。由圖2-a可知，樣品M1與其他樣品差異較大，PC2很好地將M1和其他樣品區(qū)分開來；由圖2-b可知，樣品M2、M4與其他樣品差異較大，PC2 可以將其與其他樣品完全區(qū)分開。傳統(tǒng)臘肉的加工原料、加工工藝、加工環(huán)境都會直接或者間接地影響臘肉中的微生物，使得最終產(chǎn)品中的微生物有一定差異[6]。

a-細(xì)菌；b-真菌圖2 細(xì)菌主成分分析圖和真菌主成分分析圖Fig.2 principal component analysis for bacteria andprincipal component analysis for fungi

3 結(jié)論

本研究基于Illumina MiSeq高通量測序平臺分析了四川傳統(tǒng)臘肉樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性。結(jié)果表明不同臘肉樣品中的微生物多樣性存在差異，并且樣品中細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)高于真菌；臘肉中細(xì)菌和真菌群落組成分析表明，臘肉樣品中共有優(yōu)勢門為厚壁菌門(Firmicutes)和子囊菌門(Ascomycota)；樣品中的共有優(yōu)勢屬為葡萄球菌屬(Staphylococcus)和曲霉屬(Aspergillus)；PCA分析表明，不同來源的樣品間微生物組成有一定差異。