陜西茯磚茶的微生物多樣性和群落結構

楊吉霞，曾祥平，蒲慧敏，楊夏禾，賀稚非*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715) 2(重慶市計量質量檢測研究院第一分院，重慶，402260)

茯磚茶是以黑毛茶為原料，經過汽蒸、渥堆、壓制成型、發花等工藝精制而成的一種黑茶[1]。茯磚茶屬于后發酵茶，微生物對其獨特品質的形成具有重要意義，它們以茶葉為培養基生長繁殖產生金黃色閉囊殼，形成茶磚內部肉眼可見的金黃色顆粒，俗稱“金花”，同時通過代謝活動轉化茶葉的各種成分，形成獨特的色香味品質特征，茶葉泡水湯色橙紅或黃色，味道醇厚甘甜，散發濃郁的“菌花香”或者茯苓草藥香[2-3]。陜西是茯磚茶的起源地，相傳漢代茶商運輸黑毛茶經過涇陽，不慎將茶落入河里，數月之后發現茶葉上布滿“金花”。茶葉最早于涇陽自然“發花”成功，得益于其環境中的天然微生物，以及適宜“金花菌”生長繁殖的氣候、水質、溫度、濕度等自然條件[4]。曾經有“離開了涇河的水、關中的氣候、陜西人的技術不能制”的“三不能制”說法[3]，印證了陜西特有的自然條件和技術造就了獨特的茯磚茶。

我國學者從1940年代開始[5-6]，圍繞茯磚茶的微生物開展了大量研究，其進展主要有2個方面：(1)闡述了“金花菌”是優勢菌群，為曲霉屬(Aspergillus)[5-7]。較多研究認為“金花”是曲霉產生的黃色閉囊殼，其中有子囊孢子，屬于有性型。曲霉(Aspergillus)是無性型的屬名，應該采用與之對應的有性型屬名——散囊菌屬(Eurotium)[5]。2012年國際曲霉委員會(International Commission onPenicilliumandAspergillus, ICPA)將Eurotium與Aspergillus同義化，采用“一菌一名”的新原則，以前包含在屬Eurotium中的菌株以Aspergillus屬名顯示[8]，因此優勢菌屬可歸結為曲霉屬。(2)論述了加工過程中微生物的變化。細菌在原料汽蒸時被全部殺死或者僅有極少數幸存，在隨后的發酵中真菌是主要的發酵微生物，除了優勢的曲霉/散囊菌之外，還存在黑曲霉、青霉、酵母等真菌種類，對發酵也有貢獻[9-10]。目前有關微生物的研究也存在一些局限，例如：(1)優勢菌群在種水平的鑒定目前還存在較大爭議，較多研究報道為冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)[9-11]，但是也有研究鑒定為謝瓦氏曲霉(Aspergilluschevalieri)[6]、阿姆斯特丹曲霉/散囊菌(Aspergillus/Eurotiumamstelodami)[12]。造成這些分歧的一個原因是研究方法，大部分研究采用培養法，根據曲霉的形態特征來判斷菌種，然而某些形態特征是不穩定的，例如培養方法不同，曲霉的子囊孢子或者分生孢子的形態和大小有可能改變，或者孢子的成熟度不同其形態也可能有差異，從而影響種類判斷[7,13]。近年的研究運用了18S rRNA/ITS基因序列分析[9,14]或者Illumina高通量測序[11]的方法鑒定優勢菌種，由于曲霉屬的序列相對比較保守，或者數據庫比對等原因，獲得的種水平信息仍然不足[7]。(2)次優勢菌群的種類研究較少。(3)針對真菌的研究多，而細菌的研究很少。因此，仍然需要更多的研究以闡明其中微生物的多樣性和群落結構。

茯磚茶微生物的研究主要集中于湖南產區的樣品，陜西產區的研究不多。陜西是茯磚茶的起源地和主產區之一，茯磚茶是地理標志性產品，陜西這一特定地域環境中生產出的茯磚茶的微生物組成可能是地域特異性的，闡明微生物的多樣性和群落結構有助于地理標志產品的保護。為此，本研究采用Illumina MiSeq測序技術研究陜西茯磚茶樣品中細菌和真菌的多樣性和群落結構。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

從陜西采集茯磚茶樣品6個，sx1、sx2、sx6采自咸陽市，sx3、sx5采自涇陽縣，sx4采自紫陽縣。

1.1.2 藥品試劑

食品基因組DNA提取試劑盒DNeasy mericon Food Kit (69514)，德國Qiagen公司；瓊脂糖Regular Agarose G-10，西班牙BIOWEST；TransStart?FastPfuDNA Polymerase，北京全式金生物技術有限公司。

PBS緩沖液：稱取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.62 g，KH2PO40.24 g，溶解于800 mL蒸餾水中，用HCl調pH值為7.4，然后加水定容至1 L。

引物：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)、806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[15]、ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[16]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 儀器設備

T100 PCR儀、Power pacbasic電泳儀，美國Bio-Rad公司；5810R高速冷凍離心機，德國eppendorf股份公司；G:BOX EF凝膠成像系統，美國Syngene公司；P100/P100+超微量分光光度計，美國Pultton公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 宏基因組DNA 的提取

分裝100 mL PBS緩沖液于500 mL三角瓶中，加入直徑2 mm的玻璃珠5 g，121 ℃滅菌20 min，冷卻后備用。準確稱取10.000 g茶葉，加入已滅菌的裝有100 mL PBS緩沖液的三角瓶中，于搖床(180 r/min，37 ℃)振蕩1 h，用紗布過濾，取濾液10 000 r/min離心 20 min，將沉淀用滅菌的PBS溶液洗1遍，用DNeasy mericon Food Kit試劑盒按照說明書的步驟提取微生物的宏基因組DNA[9,11]。用P100/P100+超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量。提取的宏基因組DNA保存于-80 ℃備用。

1.2.2 PCR擴增

用引物338F和806R擴增細菌的16S rRNA基因。20μLPCR反應體系包括：4 μL 5ⅹFastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs, 0.8 μL 5 μmol/L引物，0.4 μLFastPfu聚合酶，10 ng DNA模板。擴增程序為：95 ℃預變性3 min，30次循環(95 ℃變性30 s，57 ℃褪火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min[15]。用引物ITS1F和ITS2R擴增真菌的ITS1基因，退火溫度為55 ℃，其余條件相同[16-17]。

1.2.3 Illumina MiSeq測序

（一）享譽全國的非遺物質文化。主要有民間文藝西蘭卡普，擺手舞、銅鈴舞、板凳龍舞等特色舞蹈，薅草鑼鼓、薅秧歌、游江號子、斗鑼鼓、玩牛等民間音樂。其中，最具影響力的是世界經典民歌《太陽出來喜洋洋》，2006年被列入國家首批非物質文化遺產名錄。

經過驗證的茯磚茶樣品宏基因組DNA送上海美吉生物醫藥科技有限公司，運用Illumina MiSeq PE300平臺對細菌16S rRNA基因的V3-V4可變區測序，引物為338F和806R，長度為468 bp[15]，同時用ITS1F和ITS2R引物對真菌的ITS1區測序，長度為300 bp[16-17]。

1.2.4 數據分析

原始序列使用Trimmomatic軟件質控[18]，用FLASH軟件進行拼接[19]：(1)設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質控后長度低于50 bp的序列；(2)barcode需精確匹配，引物允許2個堿基的錯配，去除模糊堿基；(3)根據重疊堿基overlap將兩端序列進行拼接，overlap需大于10 bp。去除無法拼接的序列。將獲得的高質量序列采用定量研究微生物群落包(quantitative insights into microbial ecology，QIIME，version 1.7)[20]做生物信息分析。用UCLUST算法對序列在97%的相似度水平下進行聚類，獲得分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)[21]，將16S rRNA序列基于Silva(Release132, http://www.arb-silva.de)[22]細菌數據庫進行比對，ITS序列基于Unite(unite7.0/its_fungi，Release 7.0，http://unite.ut.ee/index.php)[23]真菌數據庫進行比對，比對閾值均為70%，得到每個OTU對應的物種分類信息，生成不同分類水平上的物種豐度表。用QIIME計算α多樣性指數Shannon、ACE、Chao1、Coverage，繪制OTU水平下的Shannon指數圖。用R語言繪制樣品在門、屬、種水平下的物種構成圖。部分數據分析在上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-Sanger免費在線云平臺中完成(https://www.i-sanger.com/)。

1.2.5 NCBI序列號

本研究中細菌的16S rRNA序列和真菌的ITS1序列被存入NCBI 的Sequence Read Archive (SRA)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，注冊號分別為BioProject ID PRJNA590942和PRJNA560449。unclassifiedAspergillusOTU的序列也提交到NCBI GenBank中，OTU38、135、59、45、71、77、118的序列注冊號依次為MN318427～MN318433。

2 結果與分析

2.1 Illumina MiSeq測序的基本數據和α多樣性指數

用PCR擴增6個茯磚茶樣品的細菌16S rRNA基因，只有sx4和sx5 樣品產生條帶，其余4個樣品沒有條帶，可能因為細菌含量很低。6個樣品的真菌ITS1基因擴增均產生條帶。用Illumina MiSeq對細菌的16S rRNA基因V3-V4可變區和真菌的ITS1基因測序，其基本數據和α多樣性指數如表1所示。Coverage均為1.000，說明測序深度已經基本覆蓋到樣品中的所有物種。樣品sx4和sx5的細菌OTU數和α多樣性指數大于真菌的數據，說明其多樣性高于真菌。

圖1為細菌和真菌在OTU水平上的Shannon曲線圖。由圖1可知，隨著測序深度的增加，物種的數量也隨之增加，當測序深度達到10 000 之后，Shannon曲線進入了平臺期，說明細菌或真菌多樣性已經不再增加，本研究的測序數量已足夠充分。

2.2 細菌和真菌在不同分類水平下的數量統計

2.3 細菌的多樣性和群落結構

樣品sx4、sx5的細菌在門、屬水平上種類構成如圖2所示。

表1 陜西茯磚茶樣品細菌和真菌多樣性測序的基本數據和α多樣性指數Table 1 The general data of Illumina MiSeq sequencing in the analysis of bacterial and fungal diversity in Shaanxi Fubrick tea samples and their alpha diversity indices

a-細菌；b-真菌圖1 陜西茯磚茶樣品細菌和真菌在OTU水平的Shannon指數圖Fig.1 The Shannon's diversity index curves generatedfrom the OTU data of bacteria and fungi present in ShaanxiFu brick tea samples

表2 陜西茯磚茶樣品的細菌和真菌在不同分類水平下的數量統計Table 2 The statistical table of the distribution of bacteriaand fungi at different taxonomic levels in Shaanxi Fubrick tea samples

2.4 真菌的多樣性和群落結構

茯磚茶樣品的真菌種類構成如圖3所示。最優勢的門是子囊菌門Ascomycota，6個樣品的平均相對豐度為99.67%，其次為擔子菌門Basidiomycota(0.20%)、unclassified_k_Fungi(0.10%)、接合菌門zygomycota(0.03%)。最優勢的屬是曲霉屬Aspergillus，平均相對豐度為99.123%，還包括酵母：念珠菌Candida(0.230%)、Cyberlindnera(0.167%)、隱球菌屬Cryptococcus(0.073%)、低溫酵母Guehomyces(0.060%)；霉菌：被孢霉屬Mortierella(0.130%)、腐質霉屬Humicola(0.110%)、鐮刀霉Fusarium(0.025%)、赤霉屬Gibberella(0.023%)、莖點霉Phoma(0.005%)；以及其他真菌：Wallemia(0.124%)、Westerdykella(0.110%)。

經過“unite7.0/its_fungi”數據庫注釋，從Aspergillus屬的序列中僅鑒定出3個種：Aspergilluscibarius、Aspergilluspiperis、Aspergilluspenicillioides，平均相對豐度分別為4.138%、0.879%、0.019%，其余相對豐度94.591%的序列未能得到種水平信息。unclassified_g_Aspergillus的序列共有7條，其OTU編號為38、135、59、71、118、45、77，將它們輸入GenBank數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對，得到的種類鑒定結果如表3所示。OTU118的Query Coverage只有85%，即與數據庫中序列重合度只有85%，其余15%的序列無參考序列與之比對，盡管序列相似度(Percent Identity)達到100%，其菌種鑒定結果有可能不可靠。與序列OTU38、135、59、71匹配度最高的參考序列都為曲霉屬的序列，同源性大于99%，但是存在多個菌種，即可能為阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami、謝瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri、Eurotiumsp.、Aspergillusspiculosus、Aspergillusheterocaryoticus、Aspergillussp.、Aspergillusruber、Aspergilluscristatus中的一種或幾種，由于ITS1序列同源性比較高而不容易區分。根據真菌ITS序列鑒定的原則，如果所提交序列與數據庫中最匹配序列為同屬內不同種之間的序列，并且序列的同源性均≥98%時，認為其可鑒定至屬一級[24]，即可認為序列OTU38、135、59、71鑒定至屬Aspergillus。類似地OTU77也可能為Aspergillusversicolor、Aspergilluscreber、Aspergillusprotuberus中的一種或幾種。用MEGA (v7.0.14)軟件對這6條序列和GenBank中相應的參考序列一起采用Neighbor Joining法構建系統進化樹(圖4)，待測序列與參考序列的聚類關系與GenBank數據庫的比對結果一致。綜合上述結果可知：陜西茯磚茶中最優勢的菌種可能為阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami、謝瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri、Eurotiumsp.、Aspergillusspiculosus、Aspergillusheterocaryoticus、Aspergillussp.、Aspergillusruber、Aspergilluscristatus中的一種或幾種，其次還含有Aspergilluscibarius(4.138%)、Aspergilluspiperis(0.879%)、Aspergilluspenicillioides(0.019%)、Aspergillusgracilis(0.005 8%)等曲霉屬的菌種。

a-sx4門水平；b-sx5門水平；c-sx4屬水平；d-sx5屬水平圖2 陜西茯磚茶樣品的細菌在門和屬水平上的種類構成Fig.2 The composition of bacteria at the level of phylum and genus in Shaanxi Fu brick tea samples注：圖中標出平均相對豐度≥1%的種類，平均豐度低于1%的種類歸并為others

a-門水平；b-屬水平；c-種水平圖3 陜西茯磚茶樣品的真菌在門、屬、種水平上的種類構成Fig.3 The composition of fungi at the level of phylum, genus and species in Shaanxi Fu brick tea samples

表3 unclassified Aspergillus OTUs在NCBI BLAST網頁上的菌種鑒定結果Table 3 The identification results of unclassified Aspergillus OTUs by sequence alignmentmethod on NCBI BLAST web page

圖4 unclassified Aspergillus OTU序列的系統進化樹圖Fig.4 The phylogenetic tree of unclassified Aspergillus OTU sequences

3 討論

陜西茯磚茶樣品中只有sx4和sx5兩個樣品檢出細菌，可能因為細菌在汽蒸時幾乎全部被殺死或者僅有少數幸存。細菌優勢的屬(相對豐度>1%)包含腸球菌屬Enterococcus、乳桿菌屬Lactobacillus、阿克曼菌屬Akkermansia、狄氏副擬桿菌屬Parabacteroides、糞桿菌屬Faecalibacterium，從這些屬名中推測茯磚茶的細菌中可能存在潛在的益生菌菌株。已知的大多數益生菌菌株屬于乳桿菌屬或者腸球菌屬。近年來，人體腸道微生物的研究揭示：腸道內阿克曼粘細菌(Akkermansiamuciniphila)的豐度與肥胖癥、Ⅱ型糖尿病、動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、克羅恩病等代謝性疾病呈負相關[25-26]；狄氏副擬桿菌(Parabacteroidesdistasonis)是人體核心菌群之一，其含量與肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病等疾病狀態呈顯著負相關，可能在糖脂代謝方面發揮正向調節作用[27]；普氏糞桿菌(Faecalibacteriumprausnitzii)也是健康人群最豐富的腸道微生物之一，具有抗炎效應，可明顯改善腸道炎癥[28]。在sx5樣品中，Akkermansia、Parabacteroides、Faecalibacterium菌屬的豐度分別為15.06%、10.87%和1.18%，有可能是相關益生菌菌株的潛在來源。

陜西茯磚茶樣品真菌群落中最優勢的菌種可能為阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami、謝瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri、Eurotiumsp.、Aspergillusspiculosus、Aspergillusheterocaryoticus、Aspergillussp.、Aspergillusruber、Aspergilluscristatus中的一種或幾種。根據相對豐度最高的OTU38“number of hits”分析，可能性最高的是阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami或者謝瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri，冠突曲霉Aspergilluscristatus的hit數只有1，在進化樹(圖4)中其參考序列與OTU序列和其他菌種的參考序列之間有一定的區分度，由此推測冠突曲霉作為優勢菌種的可能性比較低。現有的陜西茯磚茶微生物研究多次報道過Aspergillus/Eurotiumamstelodami，例如孟雁南等[29]采用 Illumina Miseq 高通量測序技術研究了10個陜西茯磚茶樣品的真菌群落結構，也通過UNITE和NCBI比對，論述了“金花菌”可能為Aspergilluschevalieri、A.amstelodami、A.montevidensis、A.cristatus、A.spiculosus、A.cibarius、Eurotiumamstelodami、E.rubrum中的一種或幾種，與本研究的結果一致。呂嘉櫪等[30-31]將分離純化出的“金花菌”采用ITS序列或者18S rRNA序列分析法鑒定為阿姆斯特丹曲霉(Aspergillusamstelodami)；此外，劉石泉等[12]用PCR-DGGE法研究湖南茯磚茶發花過程中的真菌群落結構和種類，發現第10天后的優勢菌種為阿姆斯特丹散囊菌。韓省華等[32]從杭州陳置多年的茯磚茶中分離鑒定出阿姆斯特丹散囊菌。歐惠算等[33]采用分子生物學方法將六堡茶的“金花菌”鑒定為阿姆斯特丹散囊菌，該菌能夠降解茶中的茶多酚、黃酮類、游離氨基酸、可溶性糖，影響茶黃素、茶紅素、茶褐素等呈色物質的濃度，對六堡茶品質成分的轉化產生關鍵作用。這些研究論證了阿姆斯特丹曲霉/散囊菌也是產生“金花”的重要菌種之一。除了孟雁南等的文獻[29]之外，陜西茯磚茶的研究比較少報道謝瓦氏曲霉(Aspergilluschevalieri)。趙仁亮等[34]將從浙江茯磚茶中分離出的2株非優勢“金花菌”鑒定為謝瓦氏曲霉(Aspergilluschevalieri)。其余的菌種很少文獻報道為優勢菌種。由本研究的分析過程可知，曲霉屬中不同種之間ITS1序列相似度比較高，不容易區分，有必要探討更有效的基因序列或者形態特征鑒別方法。

4 結論

(1)從sx4和sx5兩個茯磚茶樣品中檢出細菌，優勢的屬(相對豐度>1%)包括：腸球菌屬Enterococcus、乳桿菌屬Lactobacillus、阿克曼菌屬Akkermansia、狄氏副擬桿菌屬Parabacteroides、糞桿菌屬Faecalibacterium，有可能為潛在的益生菌菌株的來源。

(2)從6個茯磚茶樣品中都檢出真菌，最優勢的屬是曲霉屬Aspergillus，平均相對豐度為99.123%，最優勢的種可能為阿姆斯特丹曲霉Aspergillusamstelodami、謝瓦氏曲霉Aspergilluschevalieri、Eurotiumsp.、Aspergillusspiculosus、Aspergillusheterocaryoticus、Aspergillussp.、Aspergillusruber、Aspergilluscristatus中的一種或幾種。其次還含有Aspergilluscibarius(4.138%)、Aspergilluspiperis(0.879%)、Aspergilluspenicillioides(0.019%)、Aspergillusgracilis(0.0058%)等曲霉屬的菌種。真菌群落中還存在酵母：Candida、Cyberlindnera、Cryptococcus、Guehomyces；霉菌：Mortierella、Humicola、Fusarium、Gibberella、Phoma；以及其他真菌：Wallemia、Westerdykella。

(3)本研究采用高通量測序法比較全面分析了陜西茯磚茶樣品中細菌和真菌的多樣性和群落結構。