培養條件及表面活性劑的添加對納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

馮靜靜，楊自名，吳靜，李偉，Sokhna Mbacke Gningue，趙禮軍，周文豪，薛正蓮,2，王洲,2，劉艷,2*

1(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖，241000) 2(微生物發酵安徽省工程研究中心，安徽 蕪湖，241000)

生物膜(biofilm，BF)是具有高度組織性的微生態系統，是細菌由浮游的單細胞狀態轉變為靜止的多細胞狀態的過程，隨后的生長導致了有組織的群落以及細胞分化[1]。能夠附著在非生物介質的表面以及氣液相交的界面上，分泌的細胞外聚合物(extracellular poly-mericsubatances，EPS)主要包括胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)，以此來增強對外界不利環境的抗性以及耐受能力[2-3]。作為一種細菌群體合作和競爭并存的表現形式，生物膜在細菌抵制外界有害物質入侵和外部環境壓力，調整內部細菌個體協同代謝和遺傳物質橫向傳遞等方面，起著非常重要的作用。細菌的這種群體合作的行為，賦予了很多細菌個體所不具備的特殊功能，如近些年發現的細菌生物膜抵抗外來抗生素的進入[4]、促使結直腸癌的發生[5]等，在食品加工過程中菌體附著在設備的濕潤拐角處形成生物膜，難以清除，造成設備腐蝕以及清理成本的增加。生物膜形成量的增加使其厚度增加，溫度傳感器不敏感造成生產過程中的損失。其內部調控機制成為當前學術界競相研究的熱點，也是近幾年Science、Cell及PNAS等國際頂級期刊研究報道的熱門[6-12]。同時，生物膜的形成導致細胞密度過高、營養物質有限、代謝產物的積累和細胞的高滲透壓，細菌也會承受很大的壓力。據報道，細菌也可能使用不同的附著機制來應對這些被修飾過的非生物介質，過度地使用表面活性劑也可能使細菌產生耐藥性[13]。因此，研究生物膜具有重要意義。納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto，Bsn)是革蘭氏陽性菌，屬于好氧型細菌，且具有耐熱以及較強的酸堿穩定性，在胃酸的環境下能夠存活4 h[14]。Bsn不僅能分解大分子物質，如碳水化合物、蛋白質、脂肪等，使發酵產品中擁有豐富的有機酸、氨基酸、寡糖等易被人體吸收的小分子化合物；還能在發酵時產生對人類有利的代謝產物，如具有凝血功能和治療三高(高血糖、高血壓、高血脂)的維生素K2以及高強溶血栓功能的納豆激酶[15]。因此，Bsn對于人類的健康起著重要的作用。而且有研究表明，Bsn生物膜的形成與維生素K2和納豆激酶的含量之間具有密切的關系[16]，更加明確了研究納豆芽孢桿菌生物膜的意義。本文探究了培養條件及表面活性劑的添加對Bsn生物膜形成的影響，為研究其他革蘭氏陽性菌生物膜及其致病機理提供理論基礎。

目前，對于生物膜的研究多集中在革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌和銅綠假單胞菌等，但是對于Bsn生物膜的研究卻鮮有報道，尤其是關于生物膜形成的調控因素研究。文章通過在不同溫度、pH值[17]以及幾種具有代表性的表面活性劑[13]對Bsn形成生物膜的能力進行分析，明確Bsn生物膜的形成條件，并且闡述不同代表類型的表面活性劑對生物膜形成的影響特性，從而為研究生物膜奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和培養基

納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)CGMCC2108，由本實驗室保藏。

培養基：LB固體瓊脂培養基、LB液體培養基、胰蛋白胨大豆肉湯培養基(tryptose soya broth, TSB)。

試劑：0.1 g/100 mL結晶紫染液、33%體積分數乙酸、PBS緩沖液、葡萄糖、NaCl、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)、檸檬酸二銨、苯扎溴銨，上海生工生物有限公司。

雙層振蕩培養箱，知楚儀器；1510全波長酶標儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制

LB液體培養基(g/L)：NaCl 10、胰蛋白胨10、酵母提取物5。固體培養基即加入2 g/L的瓊脂粉。

TSB培養基(g/L)：胰蛋白胨17、大豆木瓜蛋白酶消化物3、NaCl 5、K2HPO42.5、葡萄糖2.5。

1.2.2 納豆芽孢桿菌菌種活化及培養

從-80 ℃的冰箱中取出1管菌種在LB固體培養基上劃線分離單菌落，挑取單菌落于裝有30 mL LB液體培養基的250 mL搖瓶中，37 ℃搖床培養12～16 h，吸取2 mL轉接至50 mL TSB液體培養基中37 ℃振蕩培養12～16 h至對數生長期。

1.2.3 改良微孔板法

以有蓋的24孔板為載體，每孔中加入300 μL的菌液，然后加入2.5 mL的新鮮TSB培養基，3個重復孔，并且以空TSB培養基作為對照，37 ℃培養72 h定量測定生物膜。首先緩慢移除每孔中的培養物，然后用PBS緩沖液清洗2～3次，洗去未黏附的菌體，自然干燥后加入3 mL 0.1 g/mL的結晶紫染液進行染色20 min，再用PBS進行緩慢沖洗，直至流出無色為止，室溫靜置干燥，除去多余水分，隨后加入3 mL體積分數33%乙酸進行脫色15 min，最后用酶標儀測定OD570 nm的值衡量生物膜的多少。

OD570 nm是用來反映生物膜與非生物介質表面黏附的牢固程度，實驗結果的比較分析參考文獻所述方法，即：以只有TSB培養基的對照孔的平均值加上3倍標準差(ODc)與實驗組進行比較，來表示生物膜的黏附等級： OD≤ODc為無黏附(-)，ODc4ODc為強黏附(+++)[14]。

1.2.4 納豆芽孢桿菌生物膜形成時間篩選

將活化培養之后的菌液加入TSB培養基中，平行3次，37 ℃分別在12、24、36、48、60、72、84、96 h之后從恒溫培養箱中拿出，按照1.2.3的方法測定，拍照記錄。

1.2.5 培養基pH對納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

在確定生物膜形成的最佳時間后，配制不同pH值(5、6、7、8)的TSB培養基，每個水平3個平行，37 ℃培養72 h，按照1.2.3的方法測定。

1.2.6 葡萄糖和NaCl的含量對納豆芽孢桿菌成膜的影響

配制含有不同質量濃度的葡萄糖(0、1、3、5 g/100 mL)和NaCl(0、1、3、5 g/100 mL)排列組合的TSB培養基37 ℃培養72 h后，按照1.2.3的方法進行菌株的成膜性能比較。

1.2.7 培養溫度對納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

確定生物膜形成的最適pH值后，分別在不同的溫度(16、30、37、42 ℃)條件下進行培養，平行3次，按照1.2.3的方法進行定量測定。

1.2.8 不同表面活性劑對納豆芽孢桿菌成膜能力的影響

選擇不同類型的表面活性劑：陽離子型的十六烷基三乙基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide, CTAB)、陰離子型的SDS、兩性離子型的檸檬酸二銨以及非離子型的聚乙二醇-200(polyethylene glycol-200,PEG-200)。配制上述不同濃度表面活性劑(表1)的母液加入24孔板中，每個濃度3個平行，以不加表面活性劑的TSB培養基為對照，37 ℃培養72 h，測定生物膜形成量。

表1 不同類型表面活性劑加入培養基的質量濃度Table 1 The mass concentration of different surfactantsadded into the medium

2 結果與分析

2.1 納豆芽孢桿菌生物膜形成最佳時間的確定

生物膜的形成是一個有序過程，主要涉及細胞-介質表面、細胞-胞外聚合物、細胞-細胞之間的互作，形成過程包括細菌在介質表面的黏附、細菌集聚和微菌落發育以及生物膜的成熟與解離3個階段。

由圖1可知，在0～72 h之間，生物膜產生量呈現逐漸上升的趨勢，72 h生物膜產生量到達最高，隨后生物膜產生量下降，胞外聚合物的產生能夠促進生物膜剛性結構的產生，尤其是胞外多糖的產生。36、48、60、72 h處于氣液界面的生物膜都很容易挑起，但在72 h生物膜的黏附量最大；在12、24、84、96 h時生物膜松散甚至不完整，容易受到外界的影響重新變回浮游狀態。因此，36～72 h之間Bsn的生物膜處于菌體聚集和發育的穩定階段；0～24 h之間處于初始的黏附階段；72 h之后生物膜成熟并且解離進入下一個循環。

圖1 不同時間下納豆芽孢桿菌生物膜的形成Fig.1 Formation of Bsn biofilms at different times

2.2 pH值對納豆芽孢桿菌生物膜形成的影響

由圖2可知，在不同pH值的條件下，生物膜形成具有較大的差異，pH值為7時生物膜形成量最多，可能是因為7為Bsn生長的最適pH值，生長代謝旺盛，運動能力強，菌體能夠在此條件下由原來的單細胞狀態轉變為聚集的多細胞狀態，是生物膜形成的重要條件之一；但是pH值為5時生物膜基本無黏附，在試驗記錄過程中，前期并沒有生物膜形成，浮游的單細胞并沒有耐酸環境的能力；并且酸性環境會減弱細胞與物體表面的黏合力，導致生物膜產生量大幅降低。有趣的是，在72 h之后形成成熟的生物膜，然后測定不同初始pH值條件下菌液的pH值，發現pH值都維持在8.45左右，初步推測是Bsn產生生物膜，其胞外聚合物使pH值升高，但具體機制尚不明確，后續實驗會進一步進行實驗分析。

圖2 不同pH對Bsn生物膜形成的影響及其72 h之后菌液的pH值Fig.2 Effect of different pH values on biofilm formationof Bsn and pH value of bacteria solution after 72 h

2.3 不同質量濃度的葡萄糖和NaCl條件下納豆芽孢桿菌生物膜的形成

由表2可知，在37 ℃、葡萄糖質量濃度為0、NaCl質量濃度為1、3 g/100 mL的條件下以及NaCl質量濃度為5 g/100 mL, 葡萄糖質量濃度為0、1、5 g/100 mL的條件下都能夠使生物膜黏附。比較葡萄糖和NaCl單獨作用和葡萄糖和NaCl聯合作用(表2)的結果來看，Bsn在葡萄糖和NaCl聯合作用的情況下生物膜的形成率最高。我們將Mn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Na+以1.0 g/L的質量濃度加入到培養基中進行生物膜的培養，發現Na+存在的情況下生物膜的形成量最佳，Mg2+次之(圖3)。

表2 不同葡萄糖和NaCl含量下納豆芽孢桿菌生物膜的形成Table 2 Formation of Bsn biofilms at different glucoseand salt concentrations

注：括號中為測定生物膜時3個平行實驗OD570nm的平均值

圖3 不同離子對Bsn生物膜形成的影響Fig.3 Effectof different ions on biofilm formation of Bsn

NaCl作為一種無機鹽，能夠維持細胞正常的滲透壓。納豆芽孢桿菌對高鹽的耐受性[18]使其能夠在5 g/100 mL的NaCl環境中存活, Na+的存在能夠使細胞的細胞壁結構更加完整,但是過高或者過低的Na+質量濃度均會影響細胞的正常生長, 生物膜結構可能會隨鹽濃度的增加而逐漸解體, 膜密度變得疏松, 胞外多糖減少而不能使生物膜與非生物介質進行黏附。靳嘉巍等[19]的研究表明葡萄糖對表皮葡萄球菌的生物膜形成具有誘導作用, 主要是通過誘導其相關基因的表達從而使生物膜產生量增加。但生物膜的形成是一個復雜的過程, 不同的外界環境條件具有不同的信號轉導機制。

2.4 溫度的不同對納豆芽孢桿菌形成生物膜的影響

TONE等[20]研究表明溫度對生物膜的影響與葡萄糖和NaCl有關。由圖4可知，在不同溫度、葡萄糖和NaCl的質量濃度的一系列組合下，Bsn的生物膜形成具有復雜性和多樣性。不同的溫度對Bsn生物膜產生的影響顯著，隨著溫度的升高，生物膜有不斷上升的趨勢，但在42 ℃時生物膜的量出現下降，空氣干燥不利于生物膜的生長；16 ℃時生物膜形成量較少，且菌體沉淀在24孔板底部，低溫條件下，菌體生長和代謝緩慢，運動能力急劇下降，因此低溫抑制生物膜的形成。且在37 ℃條件下成膜能力最強，較高的溫度不利于生物膜的形成。

圖4 不同溫度下葡萄糖和NaCl的含量對Bsn生物膜的影響Fig.4 Effect of glucose and NaCl concentrations onbiofilm formation of Bsn at different temperatures

2.5 表面活性劑對納豆芽孢桿菌生物膜的影響

分子中具有親水基與疏水基，能富集(吸附)于界面，使界面性質發生顯著改變而出現界面活性的物質稱為表面活性劑。常用的表面活性劑為低分子量化合物，應用于生物膜抗菌劑、藥物載體與控制釋放、生物模擬、聚合物LB膜、乳液聚合等的研究。由于表面活性劑類型多樣導致作用不一，因此，本文選擇陰離子型、陽離子型、非離子型和兩性離子型的表面活性劑進行實驗,探究表面活性劑對Bsn生物膜的影響。為了確定不同的表面活性劑對Bsn的生物量沒有顯著影響，因此在把菌液加入24孔板前測定了加入1.0 g/L不同表面活性劑的Bsn的生長曲線，如圖5所示，在沒有形成生物膜之前，加入表面活性劑菌體的生物量沒有明顯的變化。

圖5 加入不同的表面活性劑后Bsn的生長曲線Fig.5 Growth curve of Bsn after adding different surfactants

2.5.1 檸檬酸二銨對納豆芽孢桿菌生物膜的影響

由圖6可知，隨著檸檬酸二銨質量濃度的增加，生物膜的形成反而降低，但是在0.8 g/L時生物膜形成量達到最高，但當質量濃度超過0.8 g/L，生物膜形成量又下降。佘鵬飛等[21]研究表明，兩性離子化合物使銅綠假單胞菌的生物膜厚度和尺寸減小。DESROSIERS等[22]通過菌落計數法進行評估，發現檸檬酸兩性離子型表面活性劑使金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的菌落數明顯減少，同時，激光共聚焦顯微鏡顯示，其生物膜的覆蓋率也明顯下降?？赡苁且驗闄幟仕岫@是一種兩性離子表面活性劑，在溶液中有兩種離子形態，在低濃度或者高濃度時能夠與胞外聚合物中的鈣離子橋結合，從而降低胞外聚合物的穩定性，使Bsn生物膜形成量減少。

2.5.2 SDS對納豆芽孢桿菌生物膜的影響

如圖6所示，SDS對Bsn的生長具有很大的影響。即使在0.2 g/L的低濃度下也不能使菌體正常生長，生物膜也基本無黏附。BOO等[23]的研究表明，陰離子抗菌劑更容易改變細胞膜的通透性，滲透到細胞中。產生此類現象的原因可能是SDS是一種陰離子表面活性劑，能夠進入到細菌內部，對細胞具有較強的穿透力，可使細胞膜崩解，與膜蛋白疏水部分結合并使其與膜分離，高濃度SDS可破壞蛋白質中的離子鍵和氫鍵等共價鍵，甚至改變蛋白質的構象。影響蛋白質結構以及使胞外聚合物中的蛋白質變性，導致生物膜不能形成或者解散脫落。

圖6 不同檸檬酸二銨和SDS質量濃度對Bsn生物膜形成的影響Fig.6 Effect of different diammonium citrate and SDSconcentrationson biofilm formation of Bsn

2.5.3 CTAB對納豆芽孢桿菌生物膜的影響

由圖7可知，在所設的質量濃度范圍內，生物膜產生量具有先上升后下降的趨勢，當CTAB的質量濃度為0.4 g/L時，生物膜量到達峰值，之后又隨著質量濃度的增加而降低，但是依然比對照組要高。MULCAHY等[24]研究發現eDNA能誘導銅綠假單胞菌陽離子抗菌肽耐藥性操縱子PA3552 PA3559的表達，從而使對陽離子抗菌劑的耐藥性增加2 560倍。eDNA是生物膜胞外聚合物的重要組分之一，穩定生物膜的空間結構，促進菌體的聚集和生物膜的黏附。促進生物膜的形成可能是因為CTAB是一種常用的陽離子型表面活性劑，能在低濃度時與胞外聚合物中的蛋白質和脂質相互作用，增加細胞膜的通透性，使胞外聚合物分泌增多，尤其是eDNA的含量；但在高濃度時，長鏈烷基能夠刺穿細胞膜，導致菌體死亡，生物膜產生量下降。在加入2.0 g/L CTAB之后OD570nm稍微出現上升，查閱文獻[25]發現,CTAB處理后存活的細菌細胞使生物膜得以再生和恢復，同時CTAB對生物膜的恢復似乎沒有抑制作用，雖然使生物膜的穩定狀態受到了影響，但是生物膜也可以通過不同的方式恢復到新的穩定狀態。

2.5.4 PEG-200對納豆芽孢桿菌生物膜的影響

由圖7可知，PEG-200對Bsn生物膜的影響在質量濃度為1.0 g/L時達到最高，低于或高于這個質量濃度時都會使生物膜的產生量降低。PEG-200是一種非離子型表面活性劑，即在水溶液中不電離，不會產生離子；具有潤濕、乳化等特性。EDGAR等[26]認為非離子型表面活性劑在高濃度時能夠抵抗細菌黏附，因為疏水基團能產生很大的排斥體積和反滲透壓，影響生物膜形成過程中高聚物的形成，從而影響生物膜的形成和穩定性。所以在大于1.0 g/L的質量濃度之后，生物膜的產生量會下降，抑制生物膜的形成。但在質量濃度為1.0 g/L時能夠促進生物膜的產生，可能是因為PEG-200能夠提供濕潤的環境，適宜生物膜的生長，另一方面是表面活性劑增加細胞膜的透性，使胞外聚合物的含量提高，促進生物膜的黏附。

圖7 不同CTAB和PEG-200質量濃度對Bsn生物膜形成的影響Fig.7 Effect of different CTAB and PEG-200 concentrat-ionson biofilm formation of Bsn

3 結論

目前，控制生物膜形成的策略有2大類：一是通過修飾改變表面性質和表面活性劑來防止細菌的黏附和生物膜的形成；二是利用物理力、酶等消除或者破壞已經形成的生物膜。本文通過采用結晶紫染色法確定Bsn生物膜形成最佳時間以及在不同溫度、pH值、營養條件和不同類型的表面活性劑對Bsn的生物膜產生的影響進行分析，篩選了檸檬酸二銨、SDS、CTAB、PEG-200這4種表面活性劑進行實驗。研究結果表明，培養條件為37 ℃、pH為7、1 g/100 mL NaCl、3 g/100 mL NaCl、5 g/100 mL NaCl、1 g/100 mL 葡萄糖-5 g/100 mL NaCl、3 g/100 mL 葡萄糖-5 g/100 mL NaCl、5 g/100 mL葡萄糖-5 g/100 mL NaCl條件下都能夠形成生物膜，且在37 ℃，培養72 h條件下，5 g/100 mL葡萄糖-5 g/100 mL NaCl成膜能力最佳。適當的鹽濃度和高溫促進生物膜的形成，檸檬酸二銨的質量濃度為0.8 g/L時能夠促進生物膜的形成，PEG-200在1.0 g/L時可以促進生物膜的形成，低于或高于這個濃度都會抑制生物膜的產生量，CTAB對Bsn生物膜的影響是先升高后降低，但都比對照組的生物膜產生量高，在0.4 g/L時達到最大值，此外，SDS對Bsn生物膜的形成具有很強的抑制作用。本研究結果能夠為Bsn的生物膜研究提供一定的實驗基礎，同時在控制其生物膜的形成方面具有借鑒意義。