唾液乳桿菌M18-6在發酵大豆蛋白體系中的應用

賈宇，董晨陽，張紅星，謝遠紅，金君華

(食品質量與安全北京實驗室，農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京農學院食品科學與工程學院，北京，102206)

豆漿是一種廣受歡迎的傳統純天然植物飲料，蛋白質含量豐富，脂肪酸和糖類的含量較低[1-2]，是在《中國居民膳食指南(2016版)》建議經常食用大豆制品[3]。

利用乳酸菌對豆漿進行發酵產酸，使大豆蛋白發生凝固[4]。發酵后的產品不僅具有豆漿中的營養成分，還增加了腸道益生菌的數量，提高多不飽和脂肪酸以及維生素等物質含量，具有促進腸道蠕動、增強免疫力等功能，使得豆乳更具有營養保健功效[5-7]。發酵豆乳與發酵牛乳相比，除不含膽固醇，主要存在2方面問題:一是大豆酸奶的風味較差，存在豆腥味、飯餿味、苦澀味等一系列不良風味[8-10];二是大豆酸奶的質地呈“豆腐狀”的微觀結構[11]，與酸奶的柔滑糊狀質構差距較大[12-13]，且存在顆粒狀、持水能力差等問題。這些問題除與豆漿的化學組分有關之外，發酵菌株也發揮著至關重要的作用。不同菌株發酵后的豆乳風味、質構及其營養效果具有顯著的區別[14]。

本研究依據發酵豆乳的凝乳時間，篩選出1株凝乳時間顯著短于已有報道的乳酸菌菌株唾液乳桿菌M18-6。該菌株可以明顯改善發酵豆乳的風味和質地，顯著提高豆乳體系對DPPH自由基清除能力，在發酵豆乳體系中具有良好的活菌貯藏穩定性，且在胃腸道消化環境下具有良好的耐受活性，為后期開發快速發酵大豆蛋白體系的益生菌菌株提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要原材料與儀器

1.1.1 菌株

唾液乳桿菌M18-6(CGMCC No. 16199)、副干酪乳桿菌M11-4(CGMCC No. 16200)，植物乳桿菌Zhang-LL、干酪乳桿菌KL1、保加利亞乳桿菌B和嗜熱鏈球菌S均保藏于北京農學院微生物實驗室。

1.1.2 主要培養基和試劑

(1)MRS液體培養基；MRS固體培養基[15]。

(2)酸性MRS液體培養基：在基礎MRS培養基成分上加蒸餾水至900 mL，用1 mol/L鹽酸以及1 mol/L氫氧化鈉分別調節pH至2.0、2.5、3.0、3.5、6.5后，蒸餾水定容至1 000 mL，分裝于試管中，121 ℃高壓滅菌15 min。

(3)膽鹽MRS液體培養基：在基礎MRS培養基成分上分別稱取0.5 g、1 g膽鹽后加蒸餾水定容至1 000 mL，調節pH至6.5后分裝于試管中，121 ℃高壓滅菌15 min。

(4)人工胃液：在滅菌的pH 2.5的磷酸緩沖液以過濾除菌的方式加入3 g/L(的胃蛋白酶和5 g/L的NaCl。

(5)人工腸液：在滅菌的pH 6.8的磷酸緩沖液以過濾除菌的方式加入1 g/L的胰蛋白酶。

(6)豆乳培養液：5 g白砂糖加至100 mL現磨豆漿中充分均勻后115 ℃ 滅菌20 min。

1.1.3 主要儀器

DL-CJ-1N超凈工作臺，北京東連哈爾濱儀器制造有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，Sanyo Electric公司；PHS-3B便攜式酸度計，上海雷磁儀器廠；THZ-C恒溫振蕩器，江蘇太倉市實驗設備廠；電熱恒溫培養箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司；Centrifuge 5417R小型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗菌株的篩選

將甘油保藏的唾液乳桿菌M18-6、副干酪乳桿菌M11-4，植物乳桿菌Zhang-LL、干酪乳桿菌KL1、保加利亞乳桿菌B和嗜熱鏈球菌S接種到MRS液體培養基中(37 ℃)，活化3代后，以106CFU/mL的接種量接種到15 mL的豆乳培養基中，37 ℃恒溫培養，完全凝固后，記錄不同菌株發酵所需凝乳時間并且測定發酵豆乳的pH、滴定酸度、活菌數，并進行初步的感官評價。

滴定酸度測定：參照GB 5009.239—2016的方法測定。以100 mL樣品消耗0.1 mol/L的NaOH體積(mL)為酸度°T[16]。

活菌數的測定：記錄37 ℃培養條件下不同菌株發酵豆乳的活菌數。

凝乳時間：從接入不同菌株的發酵豆乳試管放入37 ℃培養箱開始計時到豆乳完全凝固所需時間。

1.2.2 試驗菌株發酵體系中DPPH自由基清除率的測定

參考文獻[17-18],取發酵后的樣品溶液2 mL，再加入1 mL 0.2 mmol/L 的 DPPH·無水乙醇溶液，搖勻，避光反應 30 min，9 000 r/min 離心10 min，取上清液于紫外可見分光光度計在517 nm 處測定吸光度值Ai；以無水乙醇代替DPPH·無水乙醇溶液為空白組Aj，并以2 mL超純水和1 mL無水乙醇混合液空白調0。

1.2.3 發酵豆乳的感官評價

對后熟12 h發酵豆乳進行感官品鑒。選擇10名經過專業培訓的感官評價小組成員對由不同菌株發酵的凝固性酸豆乳進行感官評價[19]。

表1 酸豆奶感官評分標準Table 1 Soy milk Sensory Scoring Standard

1.2.4 試驗菌株貯藏穩定性評價

經37 ℃活化后的菌株以106CFU/mL的接種量分別接到豆乳培養基中，37 ℃發酵直至到達凝固點后，放置4 ℃后熟12 h，然后每隔24 h測定發酵豆乳的pH、滴定酸度、活菌數，連續測定24 d。

1.2.5 試驗菌株耐酸性評價

將活化好的M18-6的3代菌液在4 500 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，經PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌2次后重懸于等體積的新鮮的pH分別為2.0、2.5、3.0、3.5、6.5的MRS培養基中，37 ℃脅迫4 h。每隔1 h取100 μL菌液，10倍梯度稀釋傾注于MRS固體培養基上測定活菌數。

1.2.6 試驗菌株耐膽鹽評價

將活化好的M18-6的3代菌液在4 500 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，經PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌2次后重懸于等體積的新鮮的膽鹽質量濃度分別為0.05%和0.1%的MRS培養基中，37 ℃脅迫4 h。每隔1 h取100 μL菌液，10倍梯度稀釋傾注于MRS固體培養基上測定活菌數。

1.2.7 試驗菌株人工模擬胃腸道耐受評價

將活化好的M18-6的3代菌液在4 500 r/min離心10 min，收集菌體沉淀，經PBS緩沖液(pH 7.4)洗滌2次后重懸于含有人工胃腸液的MRS培養基中脅迫4 h，每隔1 h取100 μL菌液，10倍梯度稀釋傾注于MRS固體培養基上測定活菌數。

2 結果與分析

2.1 試驗菌株發酵性能評價

經活化的唾液乳桿菌M18-6、副干酪乳桿菌M11-4、植物乳桿菌Zhang-LL、干酪乳桿菌KL1、保加利亞乳桿菌乳桿菌B和嗜熱鏈球菌S發酵成的酸豆乳的性能評價。如表2所示：M18-6的凝乳時間為(2.50±0.20) h，活菌數為109CFU/mL，與其他菌株相比，表現出對豆漿良好的凝乳效果。這為M18-6菌株作為后期快速發酵豆乳的發酵劑提供基本科學參考依據。

表2 試驗菌株發酵酸豆乳的發酵性能評價Table 2 Evaluation of fermentation performance of fermented soymilk in test strains

2.2 試驗菌株發酵體系的抗氧化性評價

2.2.1 試驗菌株發酵體系的抗氧化性結果

由圖1可知，由唾液乳桿菌M18-6發酵豆乳的體系中，對DPPH自由基的清除率顯著高于空白對照組以及其他菌株的發酵體系(P<0.05)，清除率達到90%以上，具有潛在的強抗氧化性，為后續發酵豆乳的營養功能性研究指明方向。

2.3 發酵豆乳的感官評價結果

為了獲得具有良好風味、質構的發酵豆乳，對不同菌株發酵豆乳體系的色澤、滋味、氣味以及組織狀態等方面進行綜合性感官評價，總得分情況如圖2所示。

圖1 不同菌株發酵體系對DPPH自由基清除率的作用Fig.1 Effect of fermentation system of different strainson DPPH free radicals clearance rate注：*表示不同菌株發酵體系在P<0.05時有顯著性差異

圖2 不同菌株發酵豆乳感官評價總分結果Fig.2 Results of sensory evaluation of different strainsof fermented soymilk注：*表示單菌株發酵豆乳感官評價結果在P<0.05時有顯著性差異；**表示三菌株復合發酵豆乳感官評價結果在P<0.01時有極顯著性差異

結果顯示，M18-6菌株發酵的豆乳總得分顯著高于其他單菌株(P<0.05)；對于雙菌株復合發酵豆乳，3種形式復配評分結果間均沒有顯著性差異(P>0.05)；而Zhang-LL、KL1和M18-6復合3種菌株發酵的豆乳總得分為95分，極顯著高于其他菌株發酵體系(P<0.01)，具有良好的風味以及質地[20]，可能是3種菌株在發酵過程中因協同作用抑制了部分醛酮類物質的產生，為進一步研究菌株發酵性能奠定基礎。

2.4 試驗菌株的貯藏性評價結果

2.4.1 試驗菌株發酵體系貯藏期間pH、酸度的變化結果

任何產品功能性開發都離不開貯藏性結果的評價。本實驗對由不同菌株發酵的豆乳進行24 d的貯藏性評價。pH和滴定酸度變化結果如表3、4所示。隨著貯藏時間的延長，與其他發酵體系相比，M18-6菌株發酵豆乳體系中pH值和滴定酸度變化基本趨于平穩，無顯著變化，說明M18-6菌株具有良好的酸度穩定性。

表3 發酵豆乳貯藏期pH的變化Table 3 Changes in pH of fermented soymilk during storage

注：相同字母表示不同菌株之間無顯著性差異，不同字母表示同一時間點不同菌株發酵體系之間有顯著性差異(P<0.05)(下同)

表4 發酵豆乳貯藏期滴定酸度的變化 單位：°T

2.4.2 試驗菌株發酵體系貯藏期間活菌數的變化

發酵豆乳貯藏期間酸度穩定性和活菌數穩定性是益生菌產品貯藏穩定性的重要指標。貯藏期間活菌數的變化。由表5所示，隨著貯藏時間的延長，不同發酵體系中活菌數均呈下降趨勢，可能原因是菌株長期處于酸環境中，能量消耗顯著增大，在貯藏后期又由于能量嚴重缺乏導致菌體大量死亡。但是，對于單菌株發酵，M18-6發酵的體系在24 d后活菌數仍保持在108CFU/mL以上；而復合發酵發酵體系中，尤其是3種菌株發酵的體系中(Zhang-LL+KL1+M18-6) 24 d后活菌數能達到109CFU/mL以上，顯著高于雙菌株復合發酵體系(P<0.05)。

2.5 試驗菌株的耐受性評價

基于以上結果，進一步研究M18-6菌株的耐酸、耐膽鹽特性以及在模擬胃腸道環境中，M18-6菌株的存活情況，結果如圖3所示。正常人體的胃液pH在1.5～4.5之間，而乳酸菌在pH 2.0的環境中不生長[21]。圖3-A的結果表明，M18-6菌株在pH 2.0的環境中作用連續4 h，活菌數整體呈現下降趨勢，但是仍能達到108.5～109CFU/mL；圖3-C結果同樣驗證了M18-6較強的耐酸性。這對于益生菌在腸胃中存活以及更好地發揮其益生功能提供可能。

表5 發酵豆乳貯藏期活菌數的變化Table 5 Changes in viable counts of fermented soy milk during storage

A-耐酸性；B-耐膽鹽；C-耐人工胃液；D-耐人工腸液圖3 唾液乳桿菌M18-6的耐受性評價Fig.3 Tolerance evaluation of L. salivarius M18-6

耐膽鹽作為乳酸菌必備的另一種特性，乳酸菌在經過小腸上的某段部位時，必須具有較好的耐受力，人體十二指腸的膽鹽質量濃度，一般在0.03%～0.3%之間[22]。由圖3-B可知，M18-6菌株在質量濃度為 0.05% 的膽鹽作用下，4 h后活菌數仍保持在108.5CFU/mL以上，但是在質量濃度為 0.1% 的膽鹽作用下，活菌數在0～1 h內急速下降，最終保持在106CFU/mL；同時在人工腸液環境中脅迫4 h后，活菌數保持在109CFU/mL的高水平。可見試驗菌株不僅出良好的耐酸性，對膽鹽的耐受性也呈現出良好的耐受特性。這為由該試驗菌株發酵的豆乳能更好地被人體消化吸收提供功能性保障。

3 結果與討論

本文首先通過乳酸菌對豆漿的凝固時間的長短進行初次篩選，發現唾液乳桿菌M18-6在以106CFU/mL為初始接種量發酵豆漿，(2.50±0.20) h后豆漿完全凝固，這比同時用其他單一乳桿菌發酵的凝乳時間縮短0.5～1.5 h，并且與目前已有報道的乳桿菌菌株和雙歧菌株相比，凝乳時間也明顯縮短2 h[23]。此外，該菌株發酵體系還具有良好清除DPPH自由基的能力。經感官評定分析可知，M18-6菌株發酵的豆乳體系評分在單菌株發酵豆乳體系中最高，為88分，且對于Zhang-LL、KL1和M18-6 3種復合菌株發酵體系中，感官評價總得分為95分，顯著高于其他菌株發酵體系，可能是3種菌株共同作用下產酸能力強，生成的揮發性香味掩蓋了豆漿本身濃郁的豆腥味，從而散發出淡淡的清香味，給人以愉悅感，且質地較為細膩，適宜凝固型豆奶產品的研發。

進一步對菌株耐受性評價發現，M18-6菌株在模擬胃腸道壞境中脅迫4 h后活菌數仍然保持在3.16×108CFU/mL以上，這為發酵豆乳能夠更好地被人體胃腸道充分吸收提供有力的保障；最后，通過對發酵豆乳24 d內的貯藏性評價測定發現，M18-6菌株在豆乳中的存活率最終保持在108CFU/mL，為后期研究功能性發酵豆乳制品提供基礎理論依據。

4 結論

本研究對M18-6單一菌株發酵豆乳在貯藏期間的pH、滴定酸度以及活菌數的變化進行測定發現，唾液乳桿菌M18-6凝乳時間僅為(2.50±0.20) h，與商業乳酸菌發酵4 h相比，大大縮短了發酵時間；同時，良好的活菌貯藏穩定性以及潛在的高抗氧化活性，為開發快速穩定的發酵大豆蛋白體系乳酸菌菌劑提供了良好的應用前景。