富集黃酮的雞腿菇栽培及營養成分分析

鄒莉，馬依莎，孫健，王世新，王旭彤，劉增才

(東北林業大學 林學院，黑龍江 哈爾濱，150040)

雞腿菇(Coprinuscomatus)又名毛頭鬼傘，隸屬于鬼傘科(Coprinaceae)，鬼傘屬(Coprinus)[1]。其肉質鮮嫩，清香味美。雞腿菇具有蛋白質含量高、脂肪含量低、氨基酸種類豐富等特點[2]，經常食用可增強食欲、促消化[3]、提高免疫力[4]、抗腫瘤[5]、降血糖[6]、降血脂[7]等。雞腿菇對栽培的營養條件要求不高，可以利用多種碳源和氮源，因此各種農作物都可以作為雞腿菇栽培的原料。在實際生產過程中，常用棉籽殼、秸稈、酒糟、淀粉渣作培養基，原種培養基常采用麥粒、玉米芯、豆秸、麩皮等作為碳源，栽培種培養基通常是豆秸、麥麩等成分。研究發現，雞腿菇生長過程對其營養成分含量有較大影響，不同的培養基質對它的營養也有較大的影響。食用菌能夠從培養基中獲取營養物質，對培養基中的微量元素、小分子活性成分具有良好的富集作用。婁鈞翼等[8]在雞腿菇培養基中加入蔗糖，顯著提高了雞腿菇分泌漆酶的能力。玉米作為食用菌培養基代料的研究多集中在玉米桿、玉米芯、玉米皮上，而關于利用玉米須栽培食用菌的報道較少。我國的玉米種植面積為2 350萬hm2，玉米產量居世界第2位，估算玉米須的產量為700萬t以上[9]。玉米須含有多糖、皂苷、黃酮、甾醇、氨基酸、生物堿等活性成分，是中國的一種傳統中藥材，具有利尿消腫、清肝利膽等作用[10]。其中，黃酮類化合物是玉米須的主要活性成分之一，具有降血糖[11]、抗癌[12]、抗菌[13]、清熱利膽[14]等重要功能。玉米須來源豐富、價格低廉、易于采集收集、具有廣闊的研究與開發前景[15-16]。

本研究對雞腿菇進行了母種、原種和栽培種培養基配方的比較試驗，篩選出最適合雞腿菇生長的母種、原種和栽培種培養基配方。并將玉米須煮水后添加到栽培種培養基中，期望利用食用菌的富集效應，提高雞腿菇中的黃酮含量，栽培出營養價值更高的雞腿菇，為食用菌栽培原料的選擇提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞腿菇(Coprinuscomatus)菌種由東北林業大學森林保護學科提供。

蘆丁標準品、瓊脂、葡萄糖、酵母粉、蔗糖、KH2PO4、MgSO4、過磷酸鈣、苯酚、濃H2SO4、HCl、乙醇、乙醚、NaOH、NaNO2、重苯酚等均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

馬鈴薯、紅糖、麥粒、木屑、玉米芯、麩皮、玉米粉、豆秸，購自哈爾濱當地經銷商。

1.2 供試培養基

1.2.1 母種培養基

馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar, PDA)培養基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL。

1.2.2 液體種培養基

紅糖培養基：去皮馬鈴薯150 g，紅糖7.8 g，葡萄糖5.2 g，KH2PO41.04 g，D0.52 g，蛋白胨1.17 g，水1 000 mL。

馬鈴薯葡萄糖麥粒培養基：去皮馬鈴薯160 g,麥粒120 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL。

玉米粉培養基：玉米粉30 g，蔗糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO42.5 g，MgSO41 g，水1 000 mL。

1.2.3 原種培養基組成成分(均為質量分數)

麥粒培養基：麥粒88%，木屑10%，石膏2%。

玉米芯培養基：顆粒狀玉米芯88%，麩皮10%，石膏1%，蔗糖1%。

豆秸培養基：豆秸88%，麩皮10%，石膏1%，蔗糖1%。

1.2.4 栽培種培養基

對照配方為雞腿菇生產常用的栽培種配方，在此配方中添加一定量玉米須作為原料[17-18]，設計雞腿菇栽培種配方，具體配方見表1。按照表1配方稱取原料，過磷酸鈣和生石灰用水混合均勻后與豆秸、麥麩混合；玉米須放入鍋中文火煮沸并保持沸騰20 min，然后將玉米須與水煮液加入到豆秸、麥麩中混勻。調節含水量至60%左右，悶堆24 h。每種配方分裝到20個菌袋中，每袋裝培養料500 g(干料約為200 g)，121 ℃高壓蒸汽滅菌2 h。在無菌條件下，將雞腿菇原種接種到栽培種培養基表面后放入25 ℃恒溫培養箱中避光培養。

表1 栽培種培養基配方

單位：%(質量分數)

1.3 實驗方法

1.3.1 液體種培養基篩選

按1.2.2配方制備液體種培養基，并將100 mL液體種培養基分別裝入250 mL三角瓶中，滅菌后備用。在無菌條件下，將活化的母種接種在液體種培養基中，并在接種后置于恒溫振蕩器中。25 ℃、130 r/min 條件下培養7 d，獲得試驗用的液體種。每種配方設5組重復。分別測量液體菌種的菌絲體干重、菌絲球密度與直徑。

1.3.1.1 菌絲體生物量的測定

將培養好的液體菌種搖勻后吸取50 mL，置于離心管中，2 000g離心20 min，并棄去上清液。蒸餾水充分洗滌菌絲體沉淀，用濾紙過濾，當濾液無色透明后收集菌絲體，80 ℃干燥至恒重，電子天平準確稱量。以上操作重復3次，取平均值即為菌絲體的干重。按公式(1)計算：

(1)

1.3.1.2 菌絲球密度的測定

待液體菌種搖勻后，將1 mL菌液用無菌水稀釋10倍，測定菌絲球個數(a)。重復取3次菌液進行稀釋，測量稀釋10倍后的菌絲球個數a1、a2、a3，計算菌絲球密度的平均值,按公式(2)計算：

(2)

1.3.1.3 菌絲球直徑的測定

菌絲球大小可用菌絲球直徑表示，菌絲球直徑測量方法是取1 mL液體菌種用水稀釋10倍，在培養皿中將20個菌絲球排成一行，并用卡尺測定總長度，重復測量3次，最后計算菌絲球直徑的平均值。

1.3.2 原種培養基篩選

按1.2.3配方制備原種培養基，并將每種培養基分裝到20個組織培養瓶中。在無菌條件下，將15 mL液體菌種接入到原種培養基中，置于25 ℃恒溫培養箱中，避光培養直至菌絲長滿組培瓶。觀察記錄雞腿菇菌絲的生長情況，測量菌絲生長量(采用直線生長測量法)、記錄菌絲濃密和粗壯程度及菌絲顏色，將經不同處理后的菌絲生長情況進行相互比較，并計算菌絲平均生長速率[19]，按公式(3)計算：

(3)

式中：菌絲生長量，mm；培養時間，d。

1.3.3 栽培種培養基篩選

觀察記錄雞腿菇菌絲的生長情況，并測量菌絲生長量。待菌絲體長滿菌袋后，采用室內不脫袋直立覆土的方式出菇[20-21]。記錄原基形成和分化時間。待子實體成熟后，及時采收并測量子實體長度及菌柄直徑，計算單袋(鮮菇)的平均產量和生物轉化率[22],按公式(4)、(5)計算：

(4)

(5)

1.4 子實體營養成分測定

將經3種不同方式處理的雞腿菇子實體烘干，粉碎，過80目篩，裝于密封袋中備用。

1.4.1 黃酮含量的測定采用乙醇提取法

以蘆丁標準品配制標準溶液，NaNO2-Al(NO3)3法顯色后繪制標準曲線，樣品用70%(體積分數)乙醇在60 ℃水浴下浸提4 h，顯色反應后于510 nm波長下測定吸光度，并根據標準曲線計算黃酮含量(mg/g)[23]。

1.4.2 含水量的測定

采用105 ℃直接干燥法，具體步驟按 GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》第一法測定[24]。

1.4.3 粗總糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測量，100 ℃水浴下用HCl浸提3 h，測得吸光度后，換算得到總糖含量(mg/g)[25]。

1.4.4 粗蛋白含量的測定

采用凱氏定氮法，具體步驟參照GB 5009.5—2016，《食品中蛋白質的測定》第一法[26]。

1.4.5 粗脂肪含量的測定

采用索氏抽提法，具體步驟參照GB/T 5009.6—2016，《食品中脂肪的測定》第一法[27]。

1.4.6 粗灰分含量的測定

具體步驟參照GB 5009.4—2016，《食品中灰分的測定》第一法[28]。

1.5 數據處理

數據由SPSS 18.0統計軟件進行One-Way ANOVA方差分析，每組數據重復3次。

2 結果與分析

2.1 液體種培養基配方篩選

由于液體培養基的流動性，使得各個菌絲片斷可以在培養基的不同部位萌芽，菌種長滿時間大幅度減少，因此液體種對于工業化生產雞腿菇很有必要。液體種的質量與培養液外觀和菌絲球密度有關，并且菌絲體生物量及菌絲球直徑也會直接影響液體菌種的質量。本研究采用紅糖、PD麥粒與玉米粉3種不同液體培養基以篩選出最佳液體培養基配方，結果如表2所示。

表2 不同液體種配方對菌絲生長的影響Table 2 Effects of different liquid culture mediums onmycelium growth

注：英文字母為不同配方間相同生長速率或菌落生長指數的差異性比較；同列數據后標不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著；同列數據后標不同大寫字母表示在P<0.01水平差異顯著(下同)

由表2可知，雞腿菇菌絲的生長狀況與液體種配方有很大關系。從培養液外觀、菌絲球密度和菌絲球直徑分析，PD麥粒培養基的菌絲球密度和菌絲體干重較低，不符合液體菌種生產要求，紅糖培養基的菌絲球密度大，菌絲球直徑適中，但紅糖液體中的菌絲球大小不均勻。綜合分析，供試的3種液體培養基配方中，以玉米粉為主要原料的配方效果最好，其菌絲體干重最大，菌絲球密度大且直徑適中，菌絲生物量最大，適合作為液體菌種的培養基，符合生產要求。因此最適合雞腿菇液體菌種的培養基配方為玉米粉培養基。

2.2 原種培養基配方篩選

由于母種和液體種的菌絲較為細弱，在栽培培養基中適應性較差，不適合用來直接栽培；因此，在原種培養基擴繁后，菌絲更為粗壯更能適應栽培種培養基的生長環境。本研究采用麥粒、玉米芯與豆秸3種不同培養基以篩選最佳原種培養基配方，結果如表3所示。

表3 不同原種配方對菌絲生長的影響Table 3 Effects of different original mediums onmycelium growth

注：+++表示程度高；++表示程度較高；+表示程度較低。雞腿菇菌絲色澤分為褐、黃、淡黃、灰白、潔白 5 個等級(顏色越深表示菌絲生長狀況越差)

由表3可知，不同的原種配方對雞腿菇菌絲的生長狀況和生長速率有較大影響。從菌絲生長狀況分析，麥粒配方的菌絲濃密而粗大，生長狀況最好；玉米芯配方和豆秸配方的菌絲粗壯程度相似，較細弱。從菌絲生長速率分析，麥粒配方的菌絲平均生長速率高于玉米芯和豆秸，差異極顯著。綜合分析，確定麥粒配方為雞腿菇原種培養的最佳配方。

2.3 栽培種培養基篩選

食用菌栽培種生產對栽培的優質高產起著關鍵作用。栽培種培養料配方不同，菌絲生長情況以及出菇率也會不同。本研究采取按表1設置的3種不同雞腿菇的栽培種培養基，以篩選出最佳配方，結果如表4與表5所示。

表4 不同栽培種配方對子實體形成的影響Table 4 Effects of different cultivation mediums onfruiting body formation

注：原基形成、子實體分化及成熟時間均為覆土后時間

由表4可知，雞腿菇菌絲在3種配方上均可生長，菌絲粗壯潔白，但雞腿菇的生長速率與栽培種的配方有關。配方Ⅰ與配方Ⅱ菌絲生長速率均高于對照，并且配方Ⅱ菌絲平均生長速率最快。子實體分化時間、子實體成熟時間由短到長順序均為配方Ⅱ<對照<配方Ⅰ，配方Ⅱ的雞腿菇從覆土到子實體完全成熟的時間比對照減少15.10%。

表5 雞腿菇商品性狀及產量Table 5 Commercial characters and yield ofCoprinus comatus

由表5可知，添加玉米須水煮液的2組配方栽培的雞腿菇，在子實體長度、菌柄直徑、產量及生物轉化率方面與對照組有差異。子實體長度由長到短依次為配方Ⅱ>配方Ⅰ>對照，菌柄直徑由長到短依次為對照>配方Ⅱ>配方Ⅰ。其中，配方Ⅱ的雞腿菇子實體長，菌柄粗壯，商品性狀最好，產量和生物轉化率較高。配方Ⅰ和配方Ⅱ的產量和生物轉化率均高于對照，且差異極顯著；配方Ⅰ的產量和生物轉化率均最高，但與配方Ⅱ差異不顯著。綜合子實體大小、菌柄直徑、產量與生物轉化率差異性分析，選擇配方Ⅰ為栽培種的最佳配方。

2.4 子實體營養成分測定

2.4.1 黃酮含量分析

添加玉米須培養料的2組配方,栽培出的雞腿菇的黃酮含量均高于對照組(表6)。配方Ⅰ和配方Ⅱ的黃酮含量分別為(21.29±4.45)、(16.52±0.26) mg/g，含量最高的是配方Ⅰ，比對照提高91.52%，配方Ⅱ的黃酮含量相比對照提高48.43%，配方Ⅰ的黃酮含量比配方Ⅱ提高了28.87%。結果表明，玉米須及其水煮液的添加增加了雞腿菇黃酮含量，并且添加了4%(質量分數)的玉米須及其水煮液的配方黃酮含量最高。

表6 不同配方雞腿菇的黃酮含量Table 6 Effects of different medium on flavone contentin Coprinus comatus

2.4.2 其他營養成分的含量分析

在添加玉米須水煮液的配方中，雞腿菇的水分、總糖、蛋白質、脂肪含量均高于對照(表7)。其中，配方Ⅱ的水分和總糖含量最高，分別為(91.01±0.49)和(92.75±5.83) g/100 g，比對照組的(87.85±0.03)和(72.23±7.38) g/100 g高3.60%和28.41%。配方Ⅰ的蛋白質、脂肪還有灰分的含量最高，分別為(22.01±0.53)，(8.84±0.16)，(16.96±4.27) g/100 g，比對照組的(18.18±2.32)、(7.69±0.07)、(12.47±0.36) g/100 g高21.07%、14.95%、36.01%。結果表明，添加玉米須及其水煮液的培養料有利于提高雞腿菇的營養價值。

表7 不同配方雞腿菇的營養成分含量單位：g/100 g

3 結果與討論

雞腿菇在生長過程中能夠利用多種栽培料，其菌絲生長、發育和子實體的產量、品質與栽培料密切相關。添加玉米須水煮液的配方，雞腿菇菌絲生長速度高于對照組，同時，雞腿菇商品性狀生物轉化率及水分、總糖、蛋白質、脂肪的含量均優于對照組。說明該配方對雞腿菇生長有促進作用，這可能是由于玉米須中所含有的有機質及其他營養物質能夠被雞腿菇菌絲更好地吸收利用。

研究表明，食用菌在生長過程中對栽培基質中的營養成分具有富集作用[29-30]。試驗結果表明，用添加玉米須培養料的2組配方栽培出的雞腿菇黃酮含量均高于對照組。其中，添加4%(質量分數)玉米須水煮液的配方表現最為理想，配方Ⅰ雞腿菇黃酮含量為(21.29±4.45) mg/g，與對照組相比增加了91.52%。這表明，雞腿菇能夠富集玉米須中的黃酮，且栽培料種類豐富時更有利于雞腿菇的生長。而添加8%(質量分數)玉米須其黃酮含量比對照組提高48.43%，其他營養物質的含量同樣均高于對照組，但其黃酮含量和產量均低于配方Ⅰ。4%和8%(質量分數)玉米須配方對雞腿菇栽培產生差異的具體原因還需進一步研究。

綜上所述，采用玉米粉液體配方、麥粒原種配方，豆秸和麥麩中添加4%(質量分數)玉米須及其水煮液的栽培種配方栽培雞腿菇，能有效提高雞腿菇生產效率，增加黃酮、總糖、蛋白質、脂肪等營養成分含量，為玉米須的資源化利用、雞腿菇培養基配方的優化、提高雞腿菇營養物質含量的提高提供參考依據。