紫檀芪對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響

王 騰，孫華磊，葛惠娜，劉欣欣，李 星，李文杰

鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001

肥胖是一種復雜的多因素疾病，它是由脂肪過度堆積所引起，而隨著經濟發展和生活方式的改變，全球肥胖和超重人口已經從1980年的8.6億上漲至2013年的21億[1]，國內情況也不容樂觀[2]。目前所使用的治療肥胖的藥物，都存在一定的不良反應[3]。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是一種天然多酚化合物，主要存在于藍莓、葡萄等漿果中，具有抗炎、抗氧化、抑制腫瘤細胞增殖和轉移等多種功能，有研究[4]證實PTE能夠抑制前脂肪細胞增殖和脂質的堆積，從而減少脂肪組織，但PTE干預是否能夠影響前脂肪細胞分化尚未明確。因此，本研究通過建立3T3-L1前脂肪細胞分化模型，在細胞分化過程中進行PTE干預，探討PTE對前脂肪細胞分化的影響以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器PTE(純度98%，上海士鋒生物科技有限公司)，DMEM培養液(美國HyClone公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，羧甲基纖維素鈉、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、油紅O(北京索萊寶生物科技有限公司)，全細胞蛋白提取裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京鼎國昌盛生物科技有限公司)，葡萄糖檢測試劑盒、游離脂肪酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，β-actin、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ、CCAAT增強子結合蛋白(C/EBP)α多克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司)，恒溫CO2培養箱(日本SANYO公司)，超凈工作臺(山東博科生物產業有限公司)，酶標儀(美國BioTek公司)，蛋白凝膠成像儀(美國通用電氣儀器公司)。

1.2培養基配制基礎培養基：量取DMEM培養液90 mL、胎牛血清10 mL于容量瓶中，加入1 mL青鏈霉素混合液(含青霉素10 kU/mL、鏈霉素10 g/L)，混勻后用0.22 μm微孔過濾器過濾，4 ℃儲存待用。

誘導培養基A：準確量取2 mmol/L地塞米松貯存液50 μL、2 g/L胰島素貯存液0.5 mL、50 mmol/L IBMX貯存液1 mL，溶入98.5 mL基礎培養基中，混勻。現用現配。

誘導培養基B：準確量取2 g/L胰島素貯存液0.5 mL，溶入99.5 mL基礎培養基中，混勻。現用現配。

1.3細胞分化及干預3T3-L1前脂肪細胞購自中科院上海細胞庫。①細胞分化：待細胞在基礎培養基中生長至90%～100%融合時，更換新的培養基，繼續培養。48 h后更換為誘導培養基A，繼續培養48 h后更換為誘導培養基B，48 h后更換為基礎培養基，后每2 d更換1次基礎培養基，10～12 d后3T3-L1前脂肪細胞即可分化為成熟脂肪細胞。②干預：實驗設置PTE低(15 μmol/L)、中(30 μmol/L)、高(60 μmol/L)劑量組[4-5]和對照組。細胞分化過程中，在更換誘導培養基A的同時，干預組分別加入相應濃度的PTE溶液，對照組加入等體積溶劑羧甲基纖維素鈉，48 h后停止干預，并按照誘導細胞分化步驟繼續誘導細胞分化。

1.4細胞分化程度和脂質堆積測定誘導細胞分化成熟后，吸棄培養基，加入100 g/L多聚甲醛固定細胞20 min，加入適量新配制的油紅O染液室溫染色20 min，洗去背景色，顯微鏡下觀察細胞染色情況。然后使用異丙醇洗去油紅O染液，收集洗脫染液的異丙醇，使用酶標儀在510 nm處測量光密度(OD)值，以此間接反映細胞的分化程度。每組設6個復孔，實驗重復3次。

1.5細胞糖消耗量測定細胞誘導分化后，吸棄舊的培養基，用新的基礎培養基繼續培養。24 h后收集各組細胞的培養基，使用葡萄糖檢測試劑盒采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定其中葡萄糖含量，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。后用無細胞培養基中葡萄糖含量減去所測的葡萄糖含量，即為細胞的糖消耗量。每組設6個復孔，實驗重復3次。

1.6游離脂肪酸生成量測定細胞誘導分化后，更換新的基礎培養基繼續培養。24 h后收集各組細胞的培養基，使用游離脂肪酸測定試劑盒測定其中游離脂肪酸含量，測量過程嚴格按照試劑盒說明書進行。每組設6個復孔，實驗重復3次。

1.7細胞中PPARγ、C/EBPα蛋白表達的Western blot測定誘導細胞分化成功后，細胞裂解液處理細胞3～5 min，提取細胞蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，調整上樣蛋白量，并加入上樣緩沖液。60 V電壓電泳30 min，然后120 V電泳至溴酚藍指示劑距分離膠底部 1 cm，300 mA恒流2 h轉移蛋白印跡至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉液封閉90 min，加入一抗(PPARγ 抗體1∶3 000、C/EBPα 抗體1∶1 000稀釋)，4 ℃封閉過夜。洗滌后，與二抗室溫搖床孵育2 h，ECL顯色。使用Alpha軟件進行灰度值分析，以β-actin(1∶3 000稀釋)為內參，目的蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.8統計學處理采用SPSS 21.0對數據進行統計分析。不同組間油紅O染色OD值、糖消耗量、游離脂肪酸以及PPARγ、C/EBPα蛋白相對表達量的比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1PTE對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響結果見圖1、表1。鏡下可見未分化的3T3-L1前脂肪細胞呈梭形，分化后的成熟脂肪細胞則變為圓形或者近似圓形，且胞質內有脂滴聚集，經油紅O染色可以觀察到成熟脂肪細胞內的脂滴被染色。

A：前脂肪細胞(×100)；B：誘導分化12 d后的脂肪細胞(×200)；C：油紅O染色的脂肪細胞，箭頭所示為脂滴堆積(×200)

2.2各組細胞糖脂代謝的比較結果見表1。與對照組相比，各PTE劑量組細胞糖消耗量升高；高劑量組細胞的糖消耗量高于PTE低和中劑量組。與對照組相比，各PTE劑量組細胞游離脂肪酸生成量均降低，并且PTE高劑量組低于低和中劑量組。

2.3各組細胞中PPARγ和C/EBPα蛋白表達的比較結果見圖2、表2。除PTE低劑量組C/EBPα外，與對照組相比，各PTE劑量組的PPARγ和C/EBPα蛋白表達水平均下降，并且PTE高劑量組降低最明顯。

1：對照組；2：PTE低劑量組；3：PTE中劑量組；4：PTE高劑量組

表2 各組細胞中PPARγ、C/EBPα蛋白相對表達量的比較(n=3)

3 討論

正常脂肪細胞分化過程為多功能干細胞→脂肪母細胞→前脂肪細胞→成熟脂肪細胞[6]，前脂肪細胞儲存在人體各個脂肪庫中，能夠吸收、聚集脂質，從而分化為成熟脂肪細胞，成熟脂肪細胞中脂質的過度堆積會導致肥胖。有研究[7]證實前脂肪細胞的過度分化與肥胖的發生、發展密切相關，因此抑制前脂肪細胞分化可能會成為肥胖控制和治療的有效手段。本研究通過“經典雞尾酒法”誘導3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化[8]，并在細胞分化的過程中進行PTE干預，探討PTE對前脂肪細胞分化的影響。

前脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞后，有兩個主要的特征：一是細胞形態的變化，由梭形轉變為圓形或橢圓形；二是成熟脂肪細胞開始合成甘油三酯，以脂滴的形式儲存在胞質內，并且脂滴的數量和大小能夠間接反映脂肪細胞的分化程度[9]。本研究通過雞尾酒法誘導細胞分化后，細胞形態變化符合以上描述，表明誘導細胞分化成功。油紅O染液可對成熟脂肪細胞中的甘油三酯進行特異性染色，OD值檢測結果提示PTE干預能夠減少脂肪細胞分化過程中脂質的堆積，從而間接表明PTE干預能夠抑制前脂肪細胞分化。

肥胖會引起機體糖脂代謝紊亂，而糖、脂毒性往往相互影響，相互促進，形成惡性循環。脂代謝異常會抑制細胞中糖原的合成，促進糖異生，引起脂肪氧化缺陷，過量游離脂肪酸會抑制胰島素的分泌，導致糖代謝紊亂；同時長期的糖脂代謝紊亂會刺激脂肪細胞釋放多種炎性因子，妨礙胰島信號的傳導，進而加重了脂肪細胞對葡萄糖的轉運和利用障礙[10]。本研究結果顯示，PTE干預能提高脂肪細胞的糖消耗能力，同時減少游離脂肪酸的生成，提示PTE能夠改善脂肪細胞的糖脂代謝。

前脂肪細胞分化需要多種核轉錄因子的參與，其中C/EBP家族和PPAR家族是目前公認最重要的轉錄因子[11]。PPARγ是PPAR家族中最具有脂肪細胞專一性的成員，主要在脂肪細胞中表達，PPARγ在前脂肪細胞誘導分化的第2天開始轉錄，目前已有研究[12]證實PPARγ能夠調控前脂肪細胞分化，并且PPARγ基因敲除的前脂肪細胞會喪失分化能力；C/EBPα在前脂肪細胞分化過程中與PPARγ具有協同作用[13]，C/EBPα在誘導分化的第2天開始表達，但C/EBPα的表達較PPARγ晚，能使前脂肪細胞進入分化的終末階段，誘導細胞中脂滴的形成[14-15]。本研究結果提示，在一定濃度范圍內，PTE干預能夠抑制前脂肪細胞分化過程中PPARγ和C/EBPα蛋白的表達，表明PTE能夠抑制前脂肪細胞的分化。

綜上所述，PTE能夠抑制3T3-L1前脂肪細胞分化，減少分化過程中的脂質堆積，并改善脂肪細胞的糖脂代謝，其機制可能與抑制PPARγ和C/EBPα蛋白表達有關。該研究結果為肥胖的控制和預防提供了新的思路和理論依據。