miR-155對人胚肺成纖維細胞HELF增殖、凋亡和膠原蛋白合成的影響

宿利清，王立紅，賀 嵐，付秀華

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 呼和浩特 010059

有研究[1-3]報道，微小RNA(miRNA)的異常表達在肺成纖維細胞的異常增殖和膠原蛋白的合成中發(fā)揮著重要作用，并逐漸成為肺纖維化的研究熱點。miR-155是一種與肺部疾病關(guān)系密切的miRNA，已被證實在肺纖維化過程中表達上調(diào)，具有促進肺纖維化的作用[4-6]，但臨床上以miR-155為靶點的肺纖維化治療的實驗依據(jù)尚不充分。有研究[7]發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過靶向調(diào)控Smad5促進腎臟的纖維化，但其是否通過靶向調(diào)控Smad5參與肺纖維化過程尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建miR-155低表達的人胚肺成纖維細胞HELF，觀察miR-155與Smad5的靶向關(guān)系以及兩者在HELF細胞增殖、凋亡和膠原蛋白(Col-Ⅰ和Col-Ⅲ)合成中的作用，以期為以miR-155為靶點的肺纖維化治療提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要試劑Trizol試劑、Lipofectamine 2000、cDNA合成試劑盒購自美國Invitrogen公司，α-MEM培養(yǎng)基、CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。胰蛋白酶、二甲基亞砜、青霉素、鏈霉素和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Sigma公司。qRT-PCR試劑盒和PCR引物購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Scientific公司。PVDF膜購自美國Millipore公司。β-actin抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。Col-Ⅰ抗體、Col-Ⅲ抗體、山羊抗鼠/兔IgG二抗和si-Ctrl、si-Smad5均購自美國Santa Cruz公司，Smad5抗體購自美國CST公司。Smad5 3’-UTR野生型(Smad5-WT)、突變型(Smad5-MUT)質(zhì)粒和miR-155模擬物、miR-155抑制劑及其相應(yīng)的陰性對照均購自廣州銳博生物科技有限公司。miR-155上游引物序列為5’-CTCGTGGTAATGCTAATT GTGA-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTC CGAGGT-3’；內(nèi)參U6上游引物序列為5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’，下游引物序列為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。Smad5上游引物序列為5’-GTGGCATATAGGCAGGAGGA-3’，下游引物序列為5’-AACCTGAGCCACAATGAACC-3’；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5’-GGCGGCAACACCATG TACCCT-3’，下游引物序列為5’-AGGGGCCG GACTCGTCATACT-3’。

1.2細胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染人胚肺成纖維細胞HELF購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。HELF細胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含有體積分數(shù)10%胎牛血清、青-鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基。置于體積分數(shù)為5%CO2、37 ℃、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的HELF細胞以適當密度(2.5×105個/孔)鋪于6孔板上，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細胞達80%融合度時將細胞分為對照組(未轉(zhuǎn)染組)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對照)、anti-miR-155組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6 h后，更換成含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后收集各組細胞用于后續(xù)實驗。

1.33組細胞中miR-155mRNA表達的qRT-PCR檢測采用Trizol法提取對照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細胞的總RNA，并參照cDNA合成試劑盒說明書步驟合成cDNA。以cDNA為模板，U6和β-actin為內(nèi)參，按照PCR試劑盒說明書進行擴增，并采用2-ΔΔCt法計算miR-155的表達水平。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性120 s；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.43組細胞增殖的CCK-8法檢測取繼續(xù)培養(yǎng)48 h后的對照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細胞，加入CCK-8試劑10 μL/孔，反應(yīng)1 h后，上酶標儀測定490 nm處的吸光度值。實驗重復(fù)3次。

1.53組細胞凋亡的雙染法檢測收集繼續(xù)培養(yǎng)48 h后的對照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細胞，并以PBS洗滌2次。以500 μL的結(jié)合緩沖液重懸細胞后，參照凋亡試劑盒依次加入Annexin V-FITC和PI試劑各5 μL。避光條件下反應(yīng)15 min后，上流式細胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

1.63組細胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達的Western blot檢測向待測的對照組、anti-miR-NC組和anti-miR-155組HELF細胞中加入RIPA細胞裂解液，于冰上裂解30 min，離心取上清液，加入蛋白上樣緩沖液煮沸變性5 min。取變性蛋白樣品50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)PVDF膜后，以50 g/L脫脂奶粉溶液于37 ℃下封閉1 h后，加入特異性一抗(按1∶1 000稀釋)于4 ℃下反應(yīng)過夜。洗膜后，加入二抗(按1∶2 000稀釋)于37 ℃下反應(yīng)2 h。再次洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光劑顯色曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描，以β-actin為內(nèi)參，Image J軟件分析目的條帶的灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.7miR-155和Smad5靶向關(guān)系的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灱案鹘M細胞中Smad5mRNA和蛋白表達的檢測采用TargetScan(http://www.targetscan.org)生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-155的靶基因可能為Smad5。取對數(shù)生長期的HELF細胞，以適當密度接種至24孔板上，常規(guī)培養(yǎng)達75%融合度時，將細胞分為miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-155模擬物陰性對照)和miR-155組(轉(zhuǎn)染miR-155模擬物)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對照)、anti-miR-155組(轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，并以海腎質(zhì)粒的熒光值為內(nèi)參，檢測各組細胞的熒光素酶活性。采用qRT-PCR和Western blot檢測各組細胞中Smad5 mRNA和蛋白的表達。

1.8Smad5沉默逆轉(zhuǎn)miR-155低表達對HELF細胞增殖、凋亡、Smad5、膠原蛋白合成的作用取對數(shù)生長期的HELF細胞，以適當密度接種至24孔板上，常規(guī)培養(yǎng)達75%融合度時，將細胞分為anti-miR-NC組、anti-miR-155組、anti-miR-155+si-Ctrl組(共轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑和si-Ctrl)和anti-miR-155+si-Smad5組(共轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑和si-Smad5)，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行瞬時轉(zhuǎn)染。48 h后，分別檢測4組細胞的吸光度、凋亡率和細胞中Smad5、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較各組細胞中miR-155、吸光度值、凋亡率和細胞中Smad5、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達水平的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.13組細胞中miR-155表達水平、吸光度值和凋亡率的比較結(jié)果見表1。由表1可知，轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后，HELF細胞中miR-155 mRNA的表達水平較對照組明顯降低(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對照的HELF細胞中的miR-155 mRNA的表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CCK-8和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，anti-miR-155組細胞的吸光度值降低，凋亡率升高(P<0.05)；anti-miR-NC組細胞的吸光度值和凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組細胞中miR-155表達水平、細胞的吸光度值和凋亡率的比較(n=3)

2.23組細胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達的比較結(jié)果見表2。由表2可知，與對照組相比，anti-miR-NC組細胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達水平無明顯改變(P>0.05)；而anti-miR-155組中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白的表達水平降低(P<0.05)。

表2 3組細胞中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達的比較(n=3)

2.3各組細胞的熒光素酶活性和細胞中Smad5mRNA、蛋白表達的結(jié)果見表3。由表3可知，miR-155組細胞的熒光素酶活性較miR-NC組降低；而anti-miR-155組細胞的熒光素酶活性較anti-miR-NC組均升高(P<0.05)。miR-155組和anti-miR-155組細胞的熒光素酶活性較相應(yīng)對照miR-NC、anti-miR-NC組均無明顯改變(P>0.05)。miR-155組細胞中Smad5 mRNA和蛋白的表達水平低于miR-NC組(P<0.05)，anti-miR-155組細胞中Smad5 mRNA和蛋白的表達高于anti-miR-NC組(P<0.05)。

表3 各組細胞的熒光素酶活性和細胞中Smad5 mRNA、蛋白表達水平的比較(n=3)

2.4Smad5沉默逆轉(zhuǎn)miR-155低表達對HELF細胞增殖、凋亡及膠原蛋白合成的作用結(jié)果見表4。由表4可知，與anti-miR-NC組相比，只轉(zhuǎn)染miR-155抑制物下調(diào)miR-155表達后，HELF細胞的吸光度值和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ蛋白的表達水平均降低，而Smad5蛋白表達水平和細胞凋亡率均升高(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染si-Smad5后，miR-155低表達對HELF細胞的上述作用均受到抑制。

表4 各組細胞的吸光度值、凋亡率和細胞中Smad5、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ蛋白表達水平的比較(n=3)

3 討論

miRNAs是一類廣泛分布于機體組織和細胞中的單鏈小分子RNA，可通過與靶基因mRNA的3′UTR區(qū)域結(jié)合，降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，導(dǎo)致靶基因的沉默，參與調(diào)控細胞增殖、分化和凋亡等生物過程，與癌癥、閉塞性疾病和神經(jīng)性疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[8-10]。miR-155是一種多功能的miRNA，位于人21q21染色體上，可通過調(diào)控多種靶基因參與細胞的增殖、凋亡過程。例如：下調(diào)miR-155表達可通過靶向SOCS3抑制淋巴瘤細胞增殖，促進細胞凋亡[11]。在動脈粥樣硬化斑塊中上調(diào)的miR-155可通過靶向eNOS發(fā)揮促進血管平滑肌細胞增殖和遷移的作用[12]。同時，miR-155也可通過多種途徑參與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展過程。如：miR-155敲除可通過靶向腫瘤蛋白p53抑制心肌成纖維細胞增殖和分化，減少膠原沉積，進而可改善左心室功能，減少梗死面積[13]。miR-155在心梗后的纖維化過程中也發(fā)揮著重要作用，其可通過靶向調(diào)控TP53INP1的表達，促進心臟成纖維細胞的增殖、膠原合成和表型轉(zhuǎn)化，并抑制成纖維細胞凋亡[14]。

Smads蛋白家族是TGF-β超家族中一類重要的細胞因子，在調(diào)節(jié)成纖維細胞增殖和凋亡過程中發(fā)揮中重要作用[15-16]； Smad5是Smads家族中的重要成員，位于第5號染色體長臂3區(qū)1帶，被證實可通過介導(dǎo)BMP-7信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮保護機體腎臟纖維化的作用，且miR-155可通過靶向調(diào)控Smad5促進糖尿病腎病腎臟纖維化[7,17]。肺纖維化的分子機制十分復(fù)雜，肺成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質(zhì)的過度沉積是肺纖維化的重要病理特征。膠原蛋白Col-Ⅰ和Col-Ⅲ是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的重要成分，可由成纖維細胞分泌合成[18]。因此，探討成纖維細胞增殖、凋亡和膠原蛋白合成的分子機制對闡明肺纖維化發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義。盡管已有研究[6]指出，miR-155可通過靶向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LXRα發(fā)揮保護肺纖維化的作用，但miR-155是否可通過靶向Smad5參與肺成纖維細胞增殖、凋亡和膠原合成的調(diào)控機制并不清楚。本研究首先通過轉(zhuǎn)染miR-155抑制物建立miR-155低表達的人胚肺成纖維HELF細胞株，采用常規(guī)生物學(xué)手段觀察miR-155低表達對HELF細胞增殖、凋亡和膠原合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-155低表達能夠抑制HELF細胞增殖和Col-Ⅰ、Col-Ⅲ膠原蛋白的合成。這一結(jié)果反向印證了早期Kurowska-Stolarska等[6]發(fā)現(xiàn)的miR-155高表達的小鼠原代肺成纖維細胞的增殖活力和膠原合成能力增強的結(jié)論。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-155低表達可促進HELF細胞凋亡。同時，采用TargetScan軟件預(yù)測并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測發(fā)現(xiàn)，miR-155可與Smad5 3’UTR區(qū)域結(jié)合并負向調(diào)控Smad5表達；轉(zhuǎn)染si-Smad5成功沉默Smad5表達后，發(fā)現(xiàn)miR-155低表達對HELF細胞增殖、凋亡和膠原合成的作用明顯削弱。提示，miR-155可通過靶向Smad5調(diào)控肺成纖維細胞增殖、凋亡和膠原蛋白的合成，進而參與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-155在肺纖維化過程中發(fā)揮著重要作用，其低表達可通過靶向調(diào)控Smad5表達來抑制成纖維細胞增殖、膠原蛋白合成，并促進細胞凋亡。本研究僅從體外細胞水平上探討了miR-155在成纖維細胞增殖、凋亡和膠原蛋白合成的作用，后續(xù)仍需從體內(nèi)動物水平上加以驗證，為miR-155成為肺成纖維化治療的靶點提供新的參考依據(jù)。