單純自主神經功能衰竭患者周圍組織中磷酸化α-突觸核蛋白的表達

孫亞娟，周樂波，項 志，姚 靜，劉 晗，滕軍放

1)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

單純自主神經功能衰竭(pure autonomic failure，PAF)是一種罕見的散發性神經退行性疾病，成年期起病，疾病進展緩慢，缺乏有效治療辦法[1]。該病最初由Bradbury和Eggleston于1925年報道，病損選擇性累及自主神經系統，且在外周自主神經系統累及更為嚴重，其他系統不受影響，臨床主要表現為體位性低血壓、無汗、便秘、性功能障礙等[2]。大量尸檢結果發現，PAF患者以神經元或膠質細胞胞質內不溶性α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)沉積形成路易小體為特征性病理表現，主要累及藍斑、黑質、交感神經節和副交感神經節以及節前、節后自主神經元[3-8]。目前PAF的診斷主要依靠臨床癥狀，缺乏簡便易行的病理活檢部位及有效的生物標志物，誤診率高。本研究檢測了PAF患者皮膚、胃小彎及膀胱組織內磷酸化α-syn(phosphorylated α-syn, pα-syn)的表達，為PAF診斷提供可能的生物標志物。

1 對象與方法

1.1研究對象收集自2016年6月至2019年3月在鄭州大學第一附屬醫院神經內科就診的PAF患者17例，均符合1996年PAF診斷共識[9]，排除帕金森病、多系統萎縮、路易體癡呆，且未合并其他神經系統疾病。17例患者中男10例，女7例，年齡53～72(63.4±5.9)歲，病程5～16 a；17例均有直立性低血壓，15例有胃腸功能障礙，12例有泌汗障礙，男性多有性功能障礙或夜尿增多，部分女性有尿失禁或夜尿增多。對照組12例，為本院外科手術患者，排除神經系統變性疾病以及其他慢性疾病。對照組男7例，女5例，年齡49～67(61.8±4.8)歲。對所有受試者進行全面的病史采集，包括年齡、性別、起病時間、起病癥狀、病情進展程度、家族史、生活環境、吸煙飲酒史、藥物及中毒史、其他慢性疾病史等；由我院兩位神經內科專業醫師進行SCOPA-AUT量表評分[10]。本研究經過鄭州大學及鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，獲得所有受試者和(或)其家屬知情同意并簽署組織活檢知情同意書。

1.2組織取材17例PAF患者和12例對照均進行皮膚活檢；其中PAF組中完成胃小彎活檢6例、膀胱活檢5例，對照組中完成胃小彎活檢4例、膀胱活檢3例。

1.2.1 皮膚活檢 選取受試者近端和遠端皮膚部位(有毛發)，使用孔徑3 mm×3 mm的皮膚鉆孔活檢器行皮膚活檢。近端部位包括頸7椎旁區域，遠端部位包括大腿(髕骨上方15 cm)和小腿(外踝上方10 cm)。取皮過程嚴格按照無菌操作要求進行，取皮后創口消毒、壓迫止血，用無菌紗布加壓包扎。

1.2.2 胃小彎、膀胱活檢 在全麻及持續心電監護狀態下分別使用電子胃鏡、膀胱鏡及活檢鉗留取受試者胃小彎組織標本(含黏膜下層)、膀胱組織標本(含肌層)，大小約2.5 mm×2.5 mm。術后注意觀察患者生命體征及一般狀況。

1.3不同組織pα-syn表達的檢測組織標本置于40 g/L多聚甲醛溶液(pH 7.4)中，4 ℃固定24 h，常規脫水、透明、浸潤，石蠟包埋后，應用組織切片機連續切片，片厚4 μm。置于80 ℃恒溫干燥箱烘烤，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，H2O2去離子水消除內源性過氧化物酶活性，然后置于枸櫞酸鈉緩沖液進行高溫高壓抗原修復5 min，PBS洗滌。滴加正常山羊血清封閉液，隨后滴加稀釋的一抗工作液(鼠抗pα-syn抗體，購自Abcam公司，1∶500稀釋)，4 ℃環境下過夜。室溫下復溫，PBS洗滌3次。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(羊抗鼠IgG，購自博奧森公司，1∶1 500稀釋)，孵育30 min，PBS洗滌3遍。DAB顯色,蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，甘油封片。Olympus IX51顯微鏡下觀察組織細胞免疫顯色情況。拍照，每張切片選取3個視野，使用Image J v1.51軟件分別統計皮膚、胃小彎、膀胱壁組織內pα-syn免疫陽性染色面積百分比(pα-syn免疫染色陽性為胞質和胞核中棕黃色、棕褐色粗糙顆粒狀或團塊狀聚集)。

1.4統計學處理采用SPSS 23.0處理數據。應用兩獨立樣本t檢驗或確切概率法比較PAF組和對照組年齡、SCOPA-AUT總分及性別的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組臨床資料比較結果見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2兩組不同樣本組織中pα-syn的表達12例對照皮膚、胃小彎及膀胱組織中均未檢出pα-syn免疫反應陽性細胞(圖1A1、A2、A3)；PAF患者皮膚、胃小彎黏膜下層及膀胱壁肌層中可見彌漫分布的pα-syn免疫反應陽性細胞(圖1B1、B2、B3)，免疫陽性染色面積百分比分別為(11.90±0.35)%、(16.27±0.80)%、(15.88±0.89)%。

A：對照組；B：PAF組；1：皮膚真皮層；2：胃小彎黏膜下層；3：膀胱壁肌層

3 討論

PAF是一種主要累及自主神經系統的神經退行性疾病，常于成年發病，緩慢進展，可嚴重影響患者的生活質量[9]。其特征為交感和副交感神經節及節前和節后自主神經元內大量α-syn沉積[6-8]，交感神經末梢合成和釋放去甲腎上腺素不足進而導致交感神經功能障礙[7]。臨床主要表現為直立性低血壓、泌汗障礙、便秘、尿失禁、性功能障礙、快動眼睡眠障礙等[2]。迄今為止，尚缺乏診斷PAF的生物標記物，阻礙了對PAF的明確診斷和預后評估。

α-syn是分布在神經突觸前末梢和核周的可溶性蛋白質，其正常水平取決于α-syn的合成和清除之間的平衡；α-syn主要通過泛素-蛋白酶體系統降解，其清除功能障礙可能導致病理性α-syn在細胞內積聚形成包涵體，進而導致高爾基體、線粒體等細胞器功能障礙、影響突觸間遞質釋放及信號傳遞，最終引發毒性反應，導致細胞變性死亡[11-12]。

既往研究[13-16]表明，PAF患者的胸髓和骶髓的中間側柱是最常見和最嚴重的受累區域，PAF可致周圍腎上腺素能神經纖維支配受損，其中，脊髓中間外側柱細胞變性丟失與直立性低血壓癥狀有關。目前認為，其病理機制是交感神經末梢合成和釋放去甲腎上腺素較少，導致周圍血管阻力降低，靜脈回心血量減少，且心率變異性減低，使患者從臥位轉為站立位時血壓迅速降低且不能反射性升高[7, 17-19]。

皮膚活檢術是臨床常用的病理檢測手段之一，其具有創傷性小、操作簡單的優勢，且皮膚真皮層內含有支配血管和汗腺的無髓腎上腺素能和膽堿能交感神經纖維。2010年Shishido等[20]對1例PAF患者的踝部皮膚活檢，首次報道了PAF患者皮膚交感神經纖維中的pα-syn沉積，提示皮膚交感神經纖維的功能障礙可能是PAF患者少汗癥的基礎。隨后Donadio等[4]對9例PAF患者進行皮膚活檢，發現其皮膚交感神經纖維中均存在pα-syn沉積，推測皮膚活檢或可作為PAF早期診斷的手段。本研究通過免疫組化法對17例PAF患者進行皮膚活檢發現，在皮膚汗腺和血管周圍細胞內可見大量棕黃色、棕褐色粗糙顆粒狀或團塊狀聚集物，與以上研究相符。除了直立性低血壓、泌汗障礙，PAF患者還常合并尿失禁、便秘等癥狀。尸檢發現，PAF患者的結腸肌間神經叢、膀胱壁的自主神經遠端軸突中均可發現pα-syn沉積[3,6,21]，這可能與PAF患者便秘、尿失禁等癥狀密切相關。但既往病理研究多在患者死后進行，不利于PAF的早期診斷與治療。2014年Masuda等[22]首次對1例合并便秘的PAF患者行纖維結腸鏡檢查并活檢，發現其結腸肌間神經叢中存在pα-syn沉積。本研究對5例PAF患者的胃小彎、膀胱活檢發現，胃小彎黏膜下層、膀胱壁肌層可見pα-syn沉積，推測與胃腸道功能障礙及泌尿功能障礙有關。周圍器官及組織的pα-syn沉積在PAF的發病機制及臨床表現中可能有重要作用。

值得注意的是，PAF與多系統萎縮(multiple system atrophy,MSA)均可出現自主神經功能障礙癥狀，且都歸屬于α突觸核蛋白病，憑借臨床癥狀常難以鑒別。前者自主神經功能障礙癥狀可持續數十年幾乎沒有進展，預后良好，后者確診后的平均生存時間為9 a，預后較差。研究[1，8]發現，MSA患者體位性低血壓是由于心血管自主神經中樞通路受損所致，累及節前自主神經元，節后自主神經元及神經纖維保持完整，而PAF患者體位性低血壓主要是因為周圍自主神經系統受損，自主神經節前及節后纖維均受累，交感神經末梢去甲腎上腺素的合成和釋放缺乏。Donadio等[23]通過半定量評分，對手指、大腿、小腿皮膚真皮附件自主神經支配評估發現， MSA患者皮膚自主神經普遍保存完整，得分高于PAF患者，后者表現為明顯的節后交感神經去支配。因此，皮膚自主神經病理研究可能是鑒別MSA和PAF的一種可靠的方法。

綜上所述，PAF患者的皮膚、胃腸道、膀胱組織中均可發現pα-syn沉積，pα-syn或可作為PAF診斷的生物標志物。但由于本項研究臨床數據較少，尚不能確定pα-syn沉積程度與疾病病程的關系，或者組織活檢能否應用于PAF的早期診斷，還需要擴大樣本量，更進一步研究和探索。