前列腺素E2誘導大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化過程中p38MAPK信號通路蛋白的表達

才忠民，王 歡，尚 平，王 琦，李劼若

1)廣州市花都區人民醫院脊柱外科 廣州 510800 2)暨南大學附屬第一醫院運動醫學中心 廣州 510630

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種可定向分化為神經細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞的多能干細胞，因具有取材方便、增殖能力強和免疫排斥反應弱等特點，成為骨折愈合和骨再生等骨組織工程的理想種子細胞[1]，而如何使BMSCs快速向成骨細胞定向分化一直是骨損傷修復研究的熱點。前列腺素E2是一種由機體產生且分布廣泛的非肽類小分子物質，除作為炎性介質外，在促進骨形成方面也發揮著重要作用[2-4]。絲裂原活化蛋白激酶是一類參與細胞分化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是該家族中與成骨分化關系密切的重要成員[5-6]。已有研究[7]發現，前列腺素E2可誘導BMSCs成骨分化，并推測p38MAPK信號通路可能在其中發揮重要作用。本研究以前列腺素E2和p38MAPK阻斷劑SB203580處理大鼠BMSCs，檢測細胞中堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)、Runx2、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨形態發生蛋白 2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和核心結合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)mRNA的表達，探討p38MAPK信號通路是否參與了前列腺素E2誘導的BMSCs成骨分化。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器前列腺素E2高純度粉末購于美國Sigma公司，L-DMEM培養基、胎牛血清和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，SB203580和Trizol試劑購于美國Invitrogen公司，Triton X-100購于北京索萊寶公司，p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、β-actin抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，反轉錄試劑盒購于美國Thermo Fisher公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，RIPA蛋白裂解液、ALP檢測試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所，CO2培養箱和酶標儀為美國Thermo公司產品，倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品，凝膠成像儀為美國Bio-Rad公司產品，紫外分光光度計為美國MJ公司產品。

1.2BMSCs的分離、培養及分組4～6周齡SD雄性大鼠，體重80～120 g，購自山西醫科大學動物實驗中心。 將SD大鼠脫頸處死后，經體積分數75%乙醇消毒，于無菌條件下取股骨和脛骨。以L-DMEM培養基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，得到骨髓細胞懸液，采用含體積分數15%胎牛血清的L-DMEM培養基于體積分數5%CO2、37 ℃培養箱內培養，每2 d換液一次。待細胞鋪滿瓶底90%時，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶2比例傳代，收集第3代細胞進行實驗。實驗分為3組。空白組細胞用完全培養基培養；前列腺素E2組細胞用含1×10-5g/L前列腺素E2的培養液培養；前列腺素E2+SB203580組細胞首先用SB203580處理30 min，然后加入1×10-5g/L前列腺素E2的培養液培養。分組培養14 d后進行指標檢測。

1.3細胞中p-p38MAPK、p38MAPK的檢測分別收集3組細胞，加入細胞裂解液于冰上裂解30 min，離心收集上清，采用BCA法測定總蛋白的濃度及純度后，加入上樣緩沖液煮沸5 min。取變性后的總蛋白50 μg進行SDS-PAGE。蛋白分離后電轉于PVDF膜上，浸入用TBST配制的50 g/L脫脂奶粉封閉液中處理1 h。加入p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin抗體(稀釋度均為1∶1 000)于4 ℃反應24 h，封閉液洗膜15 min×3次，加入辣根過氧化酶標記的二抗(1∶2 000)于37 ℃反應1 h。暗室曝光，采用凝膠成像掃描系統分析條帶灰度值，以目的條帶與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.4細胞中ALP活性檢測分別收集3組BMSCs，以磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入0.1%Triton X-100 500 μL于4 ℃反應過夜。離心收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度，按照ALP檢測試劑盒說明書操作，檢測ALP活性，檢測波長520 nm，將結果換算為金氏單位。實驗重復3次。

1.5細胞中ALP、Runx2、OPN、BMP-2和Cbfα1mRNA的qRT-PCR法檢測分別收集3組BMSCs，采用Trizol法提取總RNA，并以紫外分光光度計測定其純度、濃度。參照反轉錄試劑盒說明，以RNA為模板合成cDNA，然后行PCR。引物序列見表1。PCR反應體系：10 μL的 2×SYBR Green qPCR Mix，正、反向引物各0.5 μL， cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：預變性95 ℃ 5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，循環40次。采用 2-ΔΔCt法計算目的mRNA的表達水平。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 22.0進行統計學分析。3組p-p38MAPK/p38MAPK比值、ALP活性，各目的mRNA表達水平的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準α=0.05。

表1 引物序列

2 結果

2.13組細胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值的比較見圖1和表2。與空白組相比，前列腺素E2組細胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值升高(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580組較前列腺素E2組降低(P<0.05)，但仍高于空白組(P<0.05)。

1：空白組；2：前列腺素E2組；3：前列腺素E2+SB203580組

2.23組細胞中ALP活性的比較ALP活性測定結果見表2。前列腺素E2組ALP活性高于空白組(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580組中ALP活性較前列腺素E2組降低(P<0.05)，與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 3組細胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值及ALP活性的比較

2.33組細胞中成骨分化相關基因ALP、Runx2和OPN mRNA表達的比較見表3。與空白組相比，前列腺素E2組細胞中ALP、Runx2和OPN mRNA表達水平均升高(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580組3個指標較前列腺素E2組降低(P<0.05)，其中Runx2和OPN mRNA表達水平仍高于空白組(P<0.05)。

表3 3組細胞中ALP、Runx2和OPN mRNA表達水平的比較

2.43組細胞中骨向分化調控因子BMP-2和Cbfα1mRNA表達的比較見表4。前列腺素E2組細胞中BMP-2 和Cbfα1 mRNA表達水平高于空白組。前列腺素E2+SB203580組細胞中BMP-2和Cbfα1 mRNA表達水平較前列腺素E2下降(P<0.05)，其中Cbfα1 mRNA表達水平低于空白組(P<0.05)。

表4 3組細胞中BMP-2和Cbfα1 mRNA表達水平的比較

3 討論

前列腺素E2在多種干細胞的增殖和分化過程中發揮了重要作用。前列腺素E2可通過PI3K/Akt信號通路誘導BMP-2生成，進而誘導肌腱干細胞向成骨細胞分化[8]；可通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進神經干細胞的增殖，并誘導其向神經元方向分化[9]；還可通過活化受體EP4增加造血干細胞的數量，調節造血系統的穩定性[10]。此外，前列腺素E2還在調控骨組織形成、骨代謝、成骨細胞增殖、膠原合成和免疫調節等過程中扮演重要角色，在BMSCs的增殖和成骨分化過程中發揮重要的促進作用[7,11-12]。但目前關于前列腺素E2誘導BMSCs成骨分化的機制并不明確。p38MAPK信號通路是細胞內重要的信號通路，其可通過三級級聯反應被磷酸化激活，參與細胞的生長、發育和分化等生理病理過程。已有報道[13-15]證實，p38MAPK信號通路在高糖誘導成骨細胞凋亡、成骨前MC3T3-E1細胞的分化以及BMSCs成骨分化過程中發揮重要作用。

ALP是成骨早期標志物，Runx2是在骨形成早期階段監管成骨分化和骨形成的重要轉錄因子，OPN是中后期成骨分化的重要標志物[16]。與p38MAPK信號通路關系密切的重要的骨轉化調控因子有BMP-2和Cbfα1；前者是骨生長的啟動因子，可通過激活p38MAPK信號通路誘導BMSCs向成骨細胞分化[17]；后者是骨向分化特異性轉錄基因，可誘導多潛能間充質干細胞向成骨細胞表型分化，激活OPN和OC等成骨基因的轉錄，抑制p38MAPK信號通路可引起Cbfα1表達下調[15,18]；兩者均是BMSCs向成骨細胞分化的重要調控因子。已有研究[18]指出，前列腺素E2可通過結合EP4受體增加間充質干細胞中BMP-2的表達。

我們在Liu等[7]研究的基礎上，選用濃度為1×10-5g/L的前列腺素E2與大鼠BMSCs體外共培養，Western blot法檢測發現共培養后BMSCs中p-p38MAPK/p38MAPK比值升高，ALP活性以及ALP、Runx2、OPN mRNA的表達升高，骨轉化調控因子BMP-2和Cbfα1 mRNA的表達也升高；利用p38MAPK阻斷劑SB203580阻斷BMSCs中p38MAPK的活化后，前列腺素E2誘導的BMSCs中p38MAPK磷酸化水平下降，ALP活性以及ALP、Runx2、OPN mRNA的表達均降低，BMP-2和Cbfα1 mRNA的表達也降低；提示p38MAPK信號通路在列腺素E2誘導BMSCs成骨分化過程中發揮了促進作用，前列腺素E2可能通過激活p38MAPK信號通路進而調控BMP-2和Cbfα1的表達，從而發揮誘導BMSCs成骨分化的作用。

綜上所述，我們認為p38MAPK信號通路參與了前列腺素E2誘導的大鼠BMSCs成骨分化的過程，其作用機制可能與上調BMP-2和Cbfα1表達有關。該研究結果為應用前列腺素E2促進骨折愈合和骨再生提供了參考依據，也為調控BMSCs成骨分化提供了作用靶點。