CSRP2在成人非M3-急性髓系白血病患者骨髓中的表達

王樹娟，王 沖，李 濤，劉 鈺，李亞飛，王偉瓊，郝倩倩，姜中興，謝新生，萬鼎銘，劉延方

鄭州大學第一附屬醫(yī)院血液科 鄭州 450052

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是起源于髓系造血干/祖細胞的惡性克隆性疾病，其分子機制和治療結(jié)果具有高度異質(zhì)性。根據(jù)染色體和基因異常進行的預(yù)后危險度分層可以指導(dǎo)治療方案的選擇，改善患者預(yù)后，但目前的危險度分層體系仍存在局限性，開發(fā)新的預(yù)后分子標志物有助于進一步優(yōu)化分層體系。半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白2(cysteine and glycine-rich protein 2，CSRP2)基因編碼LIM結(jié)構(gòu)域蛋白，參與細胞發(fā)育和分化的調(diào)節(jié)過程[1]。既往研究顯示，CSRP2與肝細胞癌去分化有關(guān)[2]；CSRP2是乳腺癌細胞偽足肌動蛋白束的成分之一，可顯著促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3-4]；CSRP2是miR-27a的下游靶標, 其表達下調(diào)可以促進胃癌細胞的增殖和運動[5]；CSRP2在成人B系急性淋巴細胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)中高表達，其高表達是正常核型成人B-ALL的獨立預(yù)后不良因素[6]。本研究旨在探討CSRP2在成人非M3-AML中的表達及其臨床意義。

1 對象和方法

1.1研究對象選取2016年1月至2017年8月我院收治的30例初治成人非M3-AML患者為研究對象，其中男18例，女12例，年齡14～77歲，中位年齡33歲。30例患者經(jīng)治療均達完全緩解，均有完整的臨床資料及隨訪資料。正常對照組為同期健康造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)供者20人。AML診斷標準參照 《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒細胞白血病)中國診療指南(2017年版)》[7]，根據(jù)初診時白血病細胞遺傳學和分子遺傳學的改變進行預(yù)后危險度分層，其中預(yù)后良好11例，預(yù)后中等16例，預(yù)后不良3例。突變基因、融合基因及染色體檢測由我院血研室采用常規(guī)方法完成。

1.2治療和隨訪誘導(dǎo)化療方案包括IA、DA和MA方案：標準劑量阿糖胞苷150 mg·m-2·d-1×7 d 聯(lián)合去甲氧柔紅霉素12 mg·m-2·d-1×3 d或柔紅霉素60 mg·m-2·d-1×3 d或米托蒽醌10 mg·m-2·d-1×3 d。緩解后治療方案為大劑量 Ara-C(2～3 g/m2，每12 h 1 次)；未行HSCT者共用4個療程；接受HSCT者共用2個療程，后行HSCT。共17例患者行HSCT，其中1例為自體HSCT，16例為異基因HSCT，具體移植方案和移植相關(guān)并發(fā)癥處理方案同文獻[8-9]。所有患者電話隨訪至2019年3月31日。隨訪時間3.1～36.8個月。無復(fù)發(fā)生存期定義為從初次緩解至首次復(fù)發(fā)的時間。復(fù)發(fā)定義為完全緩解后骨髓中白血病細胞比例>5%或外周血中出現(xiàn)白血病細胞或髓外出現(xiàn)白血病細胞[7]。

1.3CSRP2mRNA的檢測用EDTA抗凝管收集研究對象骨髓液2 mL，用紅細胞裂解液分離單個核細胞，加入1 mL Trizol(美國Invitrogen公司)充分吹打混勻，保存于-80 ℃。用經(jīng)典法提取總RNA，應(yīng)用ND-1000分光光度計檢測RNA的濃度和純度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ABI公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用美國ABI公司TaqMan?Universal PCR Master Mix試劑盒進行PCR，利用ABI 7500 FAST PCR擴增儀完成。CSRP2、ABL引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性10 min；隨后95 ℃變性15 s，60 ℃延伸1 min，共50個循環(huán)。以ABL為內(nèi)參，以標準曲線法計算CSRP2與ABL的拷貝數(shù)，曲線閾值設(shè)置為0.08[6]。以(CSRP2/ABL)作為CSRP2的表達量。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 19.0 和Graphpad Prism 5.01分析數(shù)據(jù)。CSRP2 mRNA表達水平為非正態(tài)分布資料，用中位數(shù)(上，下四分位數(shù))表示。將非M3-AML患者以CSRP2 mRNA表達水平中位數(shù)為界點分為低、高表達組。非M3-AML患者和正常對照組CSRP2 mRNA表達水平的比較，CSRP2低、高表達組間白細胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)、骨髓原始細胞比例等的比較采用Mann-WhitneyU檢驗；兩組性別、基因和染色體檢測結(jié)果、預(yù)后危險度分層、HSCT患者比例等的比較采用精確概率法；采用Kaplan-Meier法繪制兩組的無復(fù)發(fā)生存曲線并進行l(wèi)og-rank檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1初治成人非M3-AML患者和正常對照CSRP2mRNA表達的比較30例初治成人非M3-AML患者骨髓中CSRP2 mRNA的表達水平為3.42(0.22，11.08)，20例正常對照為0.41(0.32，0.71)，非M3-AML患者高于正常對照(U=174.500，P=0.009)。

2.2CSRP2mRNA低、高表達組初治成人非M3-AML患者臨床特征的比較見表2。兩組年齡、性別、初診時WBC、PLT、骨髓原始細胞比例、ETO融合基因表達、FLT3-ITD突變、NPM1突變、預(yù)后危險度分層、HSCT患者比例等差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 CSRP2低、高表達組臨床特征的比較

2.3CSRP2mRNA低、高表達組初治成人非M3-AML患者無復(fù)發(fā)生存曲線的比較Kaplan-Meier生存分析結(jié)果(圖1)顯示， CSRP2 mRNA高表達組患者預(yù)后好于CSRP2低表達組(χ2=4.384，P=0.036)。

圖1 兩組患者無復(fù)發(fā)生存曲線

3 討論

AML是成人最常見的急性白血病。細胞遺傳學異常已成為AML患者預(yù)后危險度分層的主要依據(jù)。隨著研究的深入，許多分子標記(包括基因表達異常、點突變、表觀遺傳學和蛋白質(zhì)組學等)逐漸被證實與AML關(guān)系密切。分子標志物有助于進一步深入理解AML發(fā)生發(fā)展的機制，在AML診斷、預(yù)后評估、疾病狀態(tài)監(jiān)測以及個體化治療等多方面發(fā)揮重要作用[10]。

盡管AML的預(yù)后分層體系日趨完善，但AML患者是一個異質(zhì)性較大的群體，5 a生存率低于50%[10]。目前，根據(jù)初診時細胞遺傳學和分子生物學異常可將AML患者分為預(yù)后良好、預(yù)后中等和預(yù)后不良[7]。預(yù)后良好包括t(8；21)、t(15；17)、inv(16)、t(16；16)，以及染色體核型正常的NPM1突變陽性、FLT3-ITD突變陰性者和CEBPA雙突變者；這些患者治療后緩解率可超過90%，總生存率可達60%左右[10]。預(yù)后不良包括inv(3)、t(3；3)、t(6；9)、-5,5q-、-7,7q-,以及復(fù)雜核型或染色體核型正常的FLT3-ITD突變陽性者；這群患者耐藥率高，緩解率低，復(fù)發(fā)率高，總生存率只有5%～15%。預(yù)后中等者占成人AML的45%左右，這群患者存在較大的異質(zhì)性，仍缺乏理想的治療策略，因此有必要對預(yù)后中等的患者進行進一步危險度分層[10]。既往研究[11]顯示，BAALC、MN1、ERG和AF1q等基因表達水平對預(yù)后中等患者的危險度分層有價值。

CSRP2基因位于染色體12q21.1，這一區(qū)域的缺失或突變見于多種實體腫瘤中[1]。CSRP2蛋白既存在于細胞核，亦存在于細胞質(zhì)中，細胞核中的CSRP2可促進平滑肌細胞分化[12]，細胞質(zhì)中的CSRP2可通過絲狀肌動蛋白結(jié)合到骨架蛋白上[13]。CSRP2與肝癌細胞去分化有關(guān)[2]，可顯著促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。我們前期研究[6]通過大數(shù)據(jù)篩選發(fā)現(xiàn)CSRP2在成人B-ALL中高表達，CSRP2高表達是正常核型成人B-ALL復(fù)發(fā)和生存的獨立預(yù)后不良因素，CSRP2可促進B-ALL細胞的增殖、周期進展和細胞耐藥。

AML與ALL的起源不同、發(fā)生發(fā)展機制迥異。迄今為止，CSRP2在AML中的表達及臨床意義尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)CSRP2 mRNA在成人非M3-AML患者骨髓中的表達水平高于正常對照，CSRP2 mRNA高表達的患者復(fù)發(fā)率低，無復(fù)發(fā)生存期長于CSRP2 mRNA低表達患者，提示CSRP2可能在AML病理機制中發(fā)揮不同于在B-ALL中的作用，CSRP2可能成為成人非M3-AML患者新的預(yù)后分子標志物。

本研究存在一定局限性。首先，本研究為小樣本、單中心、回顧性研究，研究結(jié)果存在一定偏倚，因此CSRP2對成人AML患者的預(yù)后意義仍需大樣本、多中心、前瞻性臨床試驗驗證。其次，CSRP2在AML中的生物學作用機制仍不明確，需進一步通過體內(nèi)外實驗探索。