表沒食子兒茶素沒食子酸酯對TNF-α誘導的小鼠成骨細胞損傷的保護作用

張艷鋒，王新浩，張曉奎，鄭 偉，宋瑞鵬

1)南陽市第二人民醫院骨科 河南南陽 473000 2)南陽南石醫院骨科 河南南陽 473000 3)鄭州大學第一附屬醫院骨科 鄭州 450052

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種退行性疾病，隨著年齡增長，患病率升高，由此引起的骨質疏松性骨折發生率逐漸增加，給社會帶來了嚴重的經濟負擔[1]。OP發生與成骨細胞凋亡過度有關，成骨細胞凋亡進程加速或數量減少可導致骨形成與吸收失衡，從而引發OP[2]。尋找有效的抑制成骨細胞凋亡的方法具有重要意義。茶多酚是茶葉的主要成分，主要包括黃酮類、黃烷醇類及兒茶素類等，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是含量最豐富且藥用活性最強的一類兒茶素[3]。近些年茶多酚類物質已被廣泛應用于抗癌和心血管疾病、抗氧化等各個領域[4-5]。研究[6]表明茶多酚可在成骨細胞增殖分化中發揮重要作用。但茶多酚對成骨細胞凋亡的影響及機制尚不清楚。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一個多效性促炎細胞因子，生物學活性廣泛，可劑量依賴性地誘導成骨細胞凋亡[7]。MC3T3-E1細胞株是從新生的C57BL/6小鼠顱頂骨分離培養而建立的成骨細胞株，常作為骨代謝研究的細胞模型[8]。本研究用EGCG干預TNF-α誘導的MC3T3-E1細胞，觀察細胞凋亡率、Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的變化，探究EGCG對成骨細胞凋亡的影響及機制。

1 材料與方法

1.1細胞來源及主要試劑、儀器MC3T3-E1細胞購自中科院上海細胞庫。EGCG、MTT及DMSO均購自美國Sigma公司。EGCG純度為95%，溶解于DMSO溶液中，濾器過濾除菌后4 ℃保存，實驗時配制成所需濃度。DMEM培養基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，TNF-α購自美國R&D公司。β-catenin、CyclinD1和Bax抗體均購自美國Abcam公司。Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD公司，酶標儀購自瑞典Tecan公司。

1.2細胞培養及實驗分組MC3T3-E1細胞用含有體積分數10% 胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養基，在體積分數5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養，每2～3 d換液1次。細胞生長面積達80%～90%時傳代，每3～4 d傳代1次。取對數期的第3代MC3T3-E1細胞，以3×103個/孔接種于96孔板，每孔加培養液100 μL，待細胞完全貼壁后分別加入0.0、7.5、15.0、30.0、60.0和120.0 μmol/L的EGCG培養72 h，每個濃度5個復孔。培養結束后MTT法檢測細胞活力。實驗重復3次。選擇30 μmol/L EGCG用于后續實驗。

實驗分為3組。空白對照組細胞常規培養；TNF-α組細胞用含40 μg/L TNF-α的DMEM培養基孵育24 h；TNF-α+EGCG組細胞用含40 μg/LTNF-α的DMEM培養基孵育24 h后，加30 μmol/L的EGCG繼續孵育72 h。

1.3MTT法檢測3組細胞活力以3×103個/孔接種第3代MC3T3-E1細胞于96孔板，按照1.2分組處理后，采用MTT法檢測細胞活力。每孔加20 μL的MTT，37 ℃孵育4 h，吸去培養上清，每孔加200 μL的DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min(以使結晶充分溶解)，用酶標儀測定490 nm處的吸光度，以此表示細胞活力。實驗重復3次。

1.43組細胞凋亡的檢測以3×105個/孔接種第3代MC3T3-E1細胞于96孔板，按照1.2分組處理后，PBS洗滌，用結合緩沖液重懸細胞，按照Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒說明操作，檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.53組細胞中 Wnt/β-catenin信號通路蛋白的檢測采用Western blot法。收集3組細胞，加入適量RIPA裂解液于在冰上反應30 min，離心，收集上清，BCA法測定蛋白濃度。按照3∶1在總蛋白中加4×蛋白上樣液，混勻后100 ℃煮沸變性5 min。按照40 μg/孔上樣，行SDS-PAGE。電泳后濕法轉膜，將膜置于50 g/L脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h，加一抗(β-catenin、CyclinD1和Bax抗體稀釋度為1∶1 000，內參GAPDH稀釋度為1∶2 000)4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，加1∶2 000稀釋的HRP標記的二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯色、顯影、定影。采用Quantity-One分析蛋白條帶灰度值。以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。實驗重復3次。

1.6統計學處理數據采用SPSS 21.0分析。不同濃度EGCG作用后MC3T3-E1細胞活力的比較，3組細胞活力、凋亡率、β-catenin、CyclinD1和Bax蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采SNK-q檢驗，檢驗水準你0.05。

2 結果

2.1不同濃度EGCG作用后MC3T3-E1細胞活力的比較如表1所示。與0.0 μmol/L EGCG比較，30.0 μmol/L EGCG作用后MC3T3-E1細胞活力增加(P<0.05)，提示一定濃度的EGCG對MC3T3-E1細胞的增殖有促進作用。因此，選擇30.0 μmol/L EGCG進行后續研究。

表1 不同濃度EGCG作用后MC3T3-E1細胞活力的比較

2.23組MC3T3-E1細胞活力與凋亡率的比較如表2所示。與空白對照組比較，TNF-α組細胞活力降低，凋亡率升高(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+EGCG組細胞活力升高，凋亡率降低(P<0.05)。

表2 3組MC3T3-E1細胞活力和凋亡率的比較

2.33組MC3T3-E1細胞中Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達的比較結果見圖1和表3。與空白對照組比較，TNF-α組β-catenin和CyclinD1表達降低，Bax表達升高(P<0.05)；與TNF-α組比較，TNF-α+EGCG組β-catenin和CyclinD1表達升高，Bax表達降低(P<0.05)。

1：空白對照組；2：TNF-α組；3：TNF-α+EGCG組

表3 3組β-catenin、CyclinD1和Bax蛋白表達水平的比較

3 討論

在活體內，骨形成位點的成骨細胞數量與成骨細胞凋亡關系密切，增加成骨細胞在重建位點的數量及延長成骨細胞壽命對骨的生長和重建有顯著的影響[9]。TNF-α是單核細胞分泌的一個炎性細胞因子，在多種骨病中表達水平升高[10]；TNF-α可抑制成骨細胞增殖、堿性磷酸酶(ALP)活性、骨鈣素產生并誘導細胞凋亡[11]，提示TNF-α可改變骨吸收與形成間的平衡。因此，抑制TNF-α誘導的成骨細胞凋亡對于骨損傷具有重要意義。研究[12-13]發現，茶多酚可增強骨礦化免疫和骨礦物質形成，增強ALP活性，提高骨密度，從而促進骨形成。Choi等[14]研究發現，用0.01～0.10 μmol/L兒茶素處理MC3T3-E1細胞48 h，細胞中ALP活性、體細胞成活率均升高，細胞凋亡受到抑制。本研究結果顯示，TNF-α可抑制MC3T3-E1細胞活力，誘導細胞凋亡；而EGCG可增強TNF-α誘導的MC3T3-E1細胞的活力，降低細胞凋亡率，提示EGCG可通過增強成骨細胞活力、抑制細胞凋亡而對TNF-α誘導的成骨細胞損傷起保護作用。

Wnt/β-catenin信號通路是細胞內一條重要的信號途徑，在調節骨形成及重建中發揮重要作用[15]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的核心調控因子，Wnt分子被激活后可與胞膜上的Frizzled、LRP5/6結合，抑制β-catenin降解，促進胞質內β-catenin蓄積，β-catenin聚集至一定量后可轉入胞核，與轉錄因子TCF/LEF互作，調節CyclinD1、Bax等靶基因的表達，從而影響成骨細胞的增殖、凋亡、分化[16-17]。CyclinD1是調控細胞周期的重要分子，在多種病變骨組織中表達降低[18]。Bcl-2家族是重要的凋亡相關分子，Bax是Bcl-2家族成員之一，發揮促凋亡作用，在多種因素引起的成骨細胞凋亡中Bax表達均升高[19]。葛根素對成骨細胞體外增殖的影響與激活Wnt/β-catenin信號通路有關[20]；循環加壓可通過激活Wnt/β-catenin信號通路刺激成骨細胞分化[21]。這些研究結果均表明激活Wnt/β-catenin信號通路可對成骨細胞損傷起保護作用。本研究結果顯示，EGCG可上調TNF-α誘導的MC3T3-E1細胞中β-catenin和CyclinD1表達，下調Bax的表達，提示EGCG對成骨細胞活力、凋亡的影響與激活Wnt/β-catenin信號通路有關。

綜上所述，EGCG可通過增強TNF-α誘導的成骨細胞活力，抑制細胞凋亡，從而對成骨細胞損傷起保護作用，其作用機制與激活Wnt/β-catenin信號通路有關。