MTHFR基因多態性與不明原因復發性流產的關系

許雅娟，班彥杰，冉利敏，余艷茹，翟閃閃，孫宗宗，張 淼，張婧喆，洪 騰，任利單，胡璐璐，王 彪，侯曉峰，石 瑛

1)鄭州大學第三附屬醫院婦產科 鄭州 450052 2)鄭州大學第三附屬醫院檢驗科 鄭州 450052

復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指2次或2次以上發生在20周之內的妊娠失敗[1-2]，發生率高達3%～5%[3]。RSA病因復雜多樣， 且50%的RSA病因不明[4]，稱為不明原因的復發性流產(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)。近年來血栓前狀態與自然流產的關系受到廣泛關注，認為胎盤部位的血栓形成可導致流產的發生[5]。研究[6]表明亞甲基四氫葉酸還原酶(methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)基因 C677T、A1298C多態性與血栓栓塞性疾病有關。盡管有研究[7]發現MTHFR C677T和A1298C多態性與URSA有關，但仍有研究[8]認為兩者關系不明確。本研究采用較大的樣本量進一步分析MTHFR基因多態性與URSA的關系，期望發現URSA的遺傳因素，為URSA的預防和治療提供依據。

1 對象與方法

1.1研究對象選取2016年9月至2018年6月于鄭州大學第三附屬醫院進行圍產保健的URSA患者230例、正常育齡期女性(對照)264例。對照組：至少有過1次正常妊娠，且無自然流產病史；URSA組：有2次及以上的不明原因自然流產病史。排除標準：經婦科、B超、子宮輸卵管造影等檢查確診生殖器解剖學畸形；夫婦雙方或胚胎染色體異常；孕早期服用致畸藥物史；胃腸手術史及嚴重的消化系統疾病、肝腎功能不全病史；冠心病、糖尿病、甲狀腺疾病、惡性腫瘤、血液系統或免疫系統疾病史；生殖道病原微生物感染；多囊卵巢綜合征、子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、宮腔粘連等婦科疾病；精神、心理疾病；不良環境因素。本研究獲得本院醫學倫理委員會批準， 所有參與者均簽署知情同意書。

1.2一般資料的收集收集2組研究對象的基本臨床信息，包括最近一次自然流產的年齡、孕前體質指數(BMI)、不良生活習慣(吸煙、飲酒)情況。

1.3MTHFR 基因C677T、A1298C多態性的檢測受檢者漱口后，利用拭子在其一側口腔頰黏膜反復刷取數次，以采集受檢者的口腔黏膜上皮脫落細胞，然后利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。采用熒光定量PCR檢測多態性，所用探針信息見表1，相關儀器、試劑均購自美國ABI公司。PCR反應體系10 μL，其中20 mg/L的DNA模板1 μL、2×Taqman Universal Master Mix 5 μL、20×Taqman-MGB探針0.5 μL、去離子水3.5 μL。反應條件為95 ℃10 min，隨后依次進行20個循環的擴增(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)和30個循環的擴增(89 ℃ 15 s，60 ℃ 90 s)，72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。反應結束后在PCR儀上讀取樣品孔中的終點熒光，利用SDS 2.4軟件將不同熒光轉變為DNA序列，從而確定各樣品的基因分型。

表1 Taqman-MGB探針序列

1.4統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。

2組民族、吸煙、飲酒等情況的比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，孕前BMI、年齡等的比較采用兩獨立樣本的t檢驗。對對照組基因型頻率進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗, 基因型和等位基因的分布采用χ2檢驗進行分析, 并計算OR及95%CI。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.12組臨床特征比較見表2。

表2 2組臨床特征比較

2.2MTHFR C677T、A1298C位點的等位基因和基因型頻率對照組MTHFR C677T(χ2=1.113,P=0.573)、A1298C(χ2<0.001，P>0.999)基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。URSA組和對照組MTHFR C677T、A1298C等位基因及基因型頻率的比較見表3、4。

表3 2組MTHFRC677T等位基因及基因型頻率的比較 例(%)

表4 2組MTHFR A1298C等位基因及基因型頻率的比較 例(%)

2.3MTHFR C677T 和 A1298C 基因連鎖分析結果2組MTHFR C677T/A1298C 復合基因型分布的比較見表5。

表5 2組MTHFR C677T/A1298C復合基因型的比較 例(%)

3 討論

RSA是多因素作用的結果。MTHFR基因位于1p36.3[9]，C677T和A1298C是MTHFR基因的2個重要多態性，突變后可使MTHFR酶活性降低，從而導致血液中同型半胱氨酸水平升高[10]，造成血管內皮損傷，導致血栓形成，而胎盤動脈栓塞可致胚胎血供不足，胚胎或胎兒缺血缺氧，最終導致流產發生[11]。

目前，對MTHFR C677T多態性與URSA的關系[7-8，12]仍存在爭議。有研究[8]表明，MTHFR 677 T等位基因和純合基因型TT均增加了URSA發生的風險。本研究結果表明URSA組MTHFR 677位點T等位基因頻率高于對照組，這與上述研究[8]結果一致。盡管有研究[7,12]提示MTHFR A1298C多態性與URSA無明顯相關性，但更多的研究[8,13]表明MTHFR 1298C等位基因是URSA的危險因素。研究[14]發現，攜帶純合突變基因型(CC)的女性URSA發生風險增加。Klai等[13]也發現攜帶突變基因C的女性發生流產的風險增加。本研究中，URSA組患者MTHFR 1298位點C等位基因頻率高于對照組，提示MTHFR 1298C等位基因是URSA發生的一個危險因素。

有學者[15]發現，與677T突變不同的是，1298C突變位于MTHFR基因的調節區域內，雜合性(1298AC)和純合性(1298CC)突變不增加同型半胱氨酸的含量，但連鎖基因型677CT/1298AC可顯著增加外周血中同型半胱氨酸的含量。研究[8]表明攜帶復合雜合子(677CT/1298AC)基因型的患者相對于具有野生型(677CC/1298AA)基因型的個體發生URSA的風險增加4.86倍。本研究中，攜帶MTHFR 677CT/1298AC復合基因型的女性發生流產的風險是具有野生型(677CC/1298AA)基因型個體的7.875倍。這說明復合雜合子基因型與URSA關系更密切，聯合檢測C677T和A1298C位點對預測URPL的意義更大。另外，本研究尚未觀察到同時攜帶3個或4個突變基因的女性，這與以往報道[8]結果一致，可能攜帶3個或4個突變基因的個體因嚴重的表型而早期被自然選擇淘汰。

綜上所述，本研究結果表明MTHFR C677T和A1298C基因多態性與URSA有關，攜帶MTHFR 677CT/1298AC復合基因型的女性URSA的發生率將升高。