北京市豬場豬圓環(huán)病毒3型感染狀況調查及其ORF2基因遺傳進化分析

李蕊，王林*，何偉勇，薛水玲，趙景義，傅彩霞，石英男，馮小宇，程敏姮，李棟梁，梅力，鄭博君

(1.北京市動物疫病預防控制中心，北京102629；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是呈二十面體對稱、無囊膜的單股環(huán)狀負鏈DNA病毒，是目前發(fā)現(xiàn)的可以自主復制的最小哺乳動物病毒[1]。目前存在PCV1、PCV2和PCV3三種血清型[2]。PCV3基因組長為2.0 kb，其基因組共有3個開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，分別編碼與圓環(huán)病毒同源的REP蛋白、Cap蛋白和一個特有的ORF3蛋白[3]。Cap蛋白是PCV的主要結構蛋白，可以在動物體內誘導產生特異性免疫反應。2015年6月，美國堪薩斯州立大學、愛荷華州立大學和史密斯菲爾德的研究人員發(fā)現(xiàn)一種新型的圓環(huán)病毒，命名為PCV3[4]。隨后，Stadejek等[5]對波蘭境內14個商品化豬場豬群血清作PCV3檢測，首次證實歐洲存在PCV3感染。Kwon等[6]對韓國豬場的豬唾液樣品進行了PCV3檢測，首次發(fā)現(xiàn)PCV3感染與流行在韓國豬群也存在。2017年宋長緒課題組對我國華南地區(qū)部分豬場進行PCV3的檢測，并報道了我國首例PCV3[7]。何啟蓋課題組從11個省份地區(qū)均檢出PCV3，并表明可以從不同的組織中檢測到PCV3[8]。

為了解PCV3在北京地區(qū)不同豬場中的流行情況，本研究擬通過建立PCR方法，對2017-2018年間北京地區(qū)不同豬場采集的樣品進行PCV3檢測，并對擴增的ORF2全基因序列進行遺傳進化樹分析，為北京地區(qū)防控PCV3提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 T Guide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker、2×Trans Taq-T PCR Super Mix、GelStain(EB替代染料)、50倍TAE電泳緩沖液(100 mL)、PBS pH 7.2 basic(1×)、Gel Extraction Kit、PMD18-T載體購自北京全式金生物技術有限公司；Trans10 感受態(tài)細胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 臨床樣品及毒株 采集2017年8月-2018年7月期間北京市8個區(qū)縣56個養(yǎng)殖場的臨床樣品，包括血清、扁桃體、淋巴結等，共采集1177份。PCV2和PCV3陽性質粒由河北農業(yè)大學惠贈。PRV、PRRSV、CSFV核酸均由疫苗中提取，保存于北京市動物疫病預防控制中心實驗室。

1.3 樣品采集 對北京市種場、規(guī)模場、散戶進行隨機血液抽樣，流產、死胎以每窩取一只為原則進行無菌剖檢，分別采集扁桃體、淋巴結、腎、肺、脾組織。冷藏運輸，-20 ℃冷凍備用。

1.4 PCV3 PCR檢測方法的建立

1.4.1 檢測引物設計 PCV3引物設計基于GenBank中已公布的PCV3全長基因序列，選取保守區(qū)域設計PCV3檢測引物(表1)。

表1 PCV3檢測引物

1.4.2 PCR擴增 以提取的樣品DNA為模板進行PCR檢測，25 μL反應體系如下：Mix反應液12.5 μL，上游引物和下游引物各0.25 μL，ddH2O 9 μL，DNA模板 3 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，35個擴增循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s)，72 ℃延伸10 min。

1.4.3 電泳檢測 配制1 %瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產物進行電泳，凝膠成像儀觀察結果，并取陽性PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證。

1.4.4 靈敏度實驗 將合成的質粒進行10倍的倍比稀釋，由1 ng/μL稀釋到1×10-5ng/μL 6個梯度，以不同稀釋度為模板，對擴增產物進行瓊脂糖電泳，以能檢出清晰特異性條帶的最大稀釋倍數為本方法的檢測極限。

1.4.5 特異性實驗 利用PCV3 PCR檢測方法，同時擴增PCV2、PCV3、PRV、PRRSV、CSFV等DNA模板，若只有PCV3擴增出326 bp的條帶，其他病毒均未擴增出條帶，并將擴增出的PCV3目的片段的PCR產物進行測序鑒定，測序結果若為目的片段，可表明該PCV3引物具有高度特異性。

1.5 PCV3 ORF2基因序列的測定

1.5.1 巢式PCR引物設計 根據PCV3 ORF2片段設計測序巢式PCR引物，為保證測序結果準確性，擴增產物均長于ORF2全長。引物信息見(表2)。

表2 PCV3 ORF2片段擴增引物

1.5.2 PCR擴增 以PCV3檢測陽性樣本的DNA為模板，PCV3-ORF2-F、PCV3-ORF2-R作為上下游引物，進行PCR擴增，50 μL反應體系如下：Mix反應液25 μL，上游引物和下游引物各1 μL，ddH2O 19 μL，DNA模板 4 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，35個擴增循環(huán)(94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s)，72 ℃延伸10 min。

再以PCR產物為模板，PCV3-ORF2-n1F、PCV3-ORF2-n1R作為上下游引物，進行PCR擴增，50 μL反應體系如下：Mix反應液25 μL，上游引物和下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL，DNA模板1 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，35個擴增循環(huán)(94 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s)，72 ℃延伸10 min。

1.6 序列分析 對PCV3 ORF2片段進行擴增，進行TA克隆、DNA測序后，通過序列分析軟件MEGA 6.0、MegAlign對PCV3的ORF2基因核苷酸序列進行分析。選取GenBank中收錄的序列作為參考，分析ORF2基因的遺傳演化關系。

從NCBI GenBank中選取52株不同國家、不同省份的PCV3 ORF2全長基因序列(表3)作為參考，進行ORF2基因的分子特征及遺傳演化分析。

2 結果與分析

2.1 PCV3 PCR檢測方法的建立

2.1.1 PCV3 PCR擴增 使用設計引物，以質粒作為陽性對照，對臨床樣本進行擴增，電泳后可以擴增出326 bp目的片段(圖1)。

2.1.2 PCV3檢測方法的靈敏度實驗 PCR擴增及電泳結果顯示，當質粒稀釋到1×10-3ng/μL能檢測出目的條帶，1×10-4ng/μL檢測不到目的條帶(圖2)，本方法的靈敏度為1×10-3ng/μL。

2.1.3 PCV3檢測方法的特異性實驗 PCR擴增及電泳檢測結果顯示，只有PCV3擴增出326 bp的條帶，其他病毒及陰性對照均未擴增出條帶(圖3)。隨機取PCR陽性產物測序，經NCBI BLAST比對，結果顯示PCR產物為PCV3片段，表明PCV3檢測方法使用的引物具有高度特異性。

表3 下載自 GenBank 的 PCV3 ORF2 參考序列信息

M:DNA Marker；1：陰性對照；2：陽性對照；3-5：部分臨床樣本

M：DNA Marker；1-6：不同稀釋濃度質粒(1 ng/μL～1×10-5ng/μL)；7：陰性對照

M：DNA Marker；1-4：依次為PCV2、PRV、PRRSV、CSFV；5：陰性對照；6：PCV3質粒

2.2 臨床樣品PCV3的PCR檢測 本研究共檢測了2017年8月-2018年7月期間采集自北京市8個區(qū)縣的1177份臨床樣品。采集樣品包括：死胎47只、流產5只、病死豬6只、血清1019份、扁桃體100份。養(yǎng)殖場包括：種場27個、規(guī)模場6個、散戶19個、屠宰場4個，共計56個場戶。表4結果顯示，PCV3檢測場陽性率為8.9%(5/56)，樣品陽性率為1.0%(12/1177)。

表4 樣品來源及PCV3檢測結果

2.2.1 不同組織中PCV3檢出情況 根據采集臨床樣品種類的不同，進行了統(tǒng)計分析(表5)，養(yǎng)殖場戶總數為58個場(戶)。結果顯示，PCV3只在血清中檢測出，組織樣品中均未檢測到PCV3。

表5 不同樣品PCV3陽性率

不同樣品種類的統(tǒng)計中，包含重復統(tǒng)計的場戶，故場數比實際多

2.3 PCV3 ORF2基因的巢式PCR擴增及變異分析 利用PCR方法擴增PCV3 ORF2全長基因，使用ORF2引物(PCV3-ORF2-F、PCV3-ORF2-R)未能擴增出1075 bp大小目的條帶，使用巢式PCR方法進行PCR檢測，產物經瓊脂糖凝膠電泳擴增出清晰830 bp條帶(圖4)。

M：DNA Marker；1：陰性對照；4-6：陽性樣本的 ORF2 全長擴增

2.4 PCV3 ORF2序列分析 本實驗共測得12株PCV3 ORF2全長基因序列，長度為645 nt，編碼214個氨基酸。使用MegAlign軟件中Clustal W方法分析同源性，結果顯示該12株序列之間的核苷酸相似性為97.7%～100.0%，12株中有7株序列一致。6株不同序列之間核苷酸相似性為97.7%～99.5%；推導氨基酸序列的相似性為97.2%～100%。與從GenBank下載的序列相比，同源性為96.0%～99.5%，推導氨基酸同源性為92.1%～100.0%。

運用MEGA 6.0軟件將本實驗獲得的6株不同的PCV3 ORF2基因與從GenBank下載的52條序列，使用Maximum Likelihood方法，Bootstrap計算1000次，繪制進化樹(圖5)。

圖5 依據 PCV3 ORF2 基因核苷酸序列繪制的進化樹

從進化樹分析可看出主要分為兩大亞群：PCV3a和PCV3b。本實驗所得6條序列及GenBank中收錄的北京毒株PCV3-BJ-1_2016(MF318453.1)、俄羅斯毒株PCV3-RU/SM17(MG679917.1)和PCV3-RU/TY17(MG679916.1)、韓國毒株PCV3/KU-1601(KY996337.1)和PCV3/KU-1602(KY996338.1)、美國毒株PCV3-US/MN2016(KX898030.1)和PCV3-US/MO2015(KX778720.1)、意大利毒株PCV3-IT/MN2017(MF162299.1)、巴西毒株PCV3-BR/RS/6(MF079253.1)處于一個大分支上屬于PCV3b基因型。

其中PCV3_BJ_2018_0201、PCV3_BJ_2018_0209、PCV3_BJ_2018_0211、PCV3_BJ_2018_0220這四條序列在一個小分支上，說明它們親緣性非常接近；PCV3_BJ_2018_0935、PCV3_BJ_2018_0205處于一個大分支上，說明它們親緣性較近；另外PCV3_BJ_2018_0205與PCV3/CN/Chongqing-150/2016、PCV3-Hebei-BD2015、PCV3-Hebei-BD2016處于一個小分支上，說明其親緣性更為接近。

3 討論與結論

PCV3是近年來發(fā)現(xiàn)的新型病毒，各研究學者的流行病學調查研究證明， PCV3已在世界及我國廣泛蔓延。本研究通過建立PCV3的PCR檢測方法對北京地區(qū)2017-2018年采集的樣本進行檢測，并對獲得的ORF2序列進行遺傳進化樹分析，了解北京地區(qū)的PCV3的流行情況，建立了PCV3的PCR檢測方法，具有較強的特異性，靈敏度性可達到1×10-3ng/μL。張志建立了豬圓環(huán)病毒3型半巢式PCR方法，該方法敏感性可達到5×10-3μg/mL，陽性檢出率可達到27.5%，與常規(guī)PCR檢出率6.25%相比有著更強敏感性[9]。本檢測方法的靈敏度與上述半巢式PCR方法相近，說明本研究建立的PCV3的PCR檢測方法靈敏度可以滿足檢測需要。本研究檢測結果顯示，北京市部分豬場存在PCV3感染，所檢測樣品中PCV3總體陽性率1.0%，場陽性率為8.9%。何泌承對2014年2月-2017年11月全國25個省、自治區(qū)和直轄市152個豬場505份樣品進行檢測，其中北京市豬場陽性率為11.1%(1/9)，樣品陽性率為1.6%(1/61)[10]。本研究檢測陽性率情況與其基本相符，可能由于其采集樣品為病死豬組織，且樣品數量較少，陽性率與本檢測數據相比稍高。本研究只在血清中檢測到PCV3，且只在散戶血清中檢測到。何啟蓋課題組在11個省份地區(qū)采集的腦、肺、淋巴結、扁桃體、精液、血清中均檢測到PCV3，檢出率最高的是大腦73.5%，而血清檢出率僅為28.7%，其他組織樣本均比血清檢出率高，說明PCV3具有組織泛嗜性，可感染多種組織[8]。可能由于本研究組織病料采集于種場及規(guī)模場，采集范圍較小，未能在組織中檢測到PCV3。馮選榕2017年首次在廣西某市屠宰健康豬群內檢出PCV3[11]，本研究未在北京市屠宰場內檢測出PCV3，可能與屠宰場樣品數量和樣品采集方法有關。本研究只在北京兩個區(qū)縣檢測出PCV3陽性，未出現(xiàn)大范圍感染的情況，但由于感染區(qū)域方位相差較遠，懷疑由不同傳染源傳入北京，若不加強PCV3的防控工作，隨著散戶豬群的流動極易擴大我市感染面積。

本研究由于PCV3陽性全部自血清中檢測出，在進行ORF2擴增時，由于病毒含量較少，未能擴出目的條帶。而巢式PCR具有特異性強和敏感性高的特點，適合病毒含量較少的組織樣品或細胞的檢測，因此本研究設計的ORF2巢式PCR引物擴增出了目的條帶，并且擴增產物均長于ORF2的全長，保證了下一步測序的準確性，為臨床上PCV3 Cap蛋白的研究提供了更為靈敏的擴增方法。本研究獲得了12條PCV3 ORF2基因全長序列，但其中有7條序列相似性為100%，該7條相同序列的樣品均采自同一區(qū)縣，同一鄉(xiāng)鎮(zhèn)，考慮可能是同一傳染源。盡管6株不同ORF2核苷酸序列存在一定的變異，但有不同毒株的核苷酸之間產生了同義突變，造成多條序列推導出的氨基酸序列相似性為100%，說明PCV3在進化過程中變異程度不大。PCV3 ORF2基因遺傳進化分析表明，PCV3毒株主要存在2個亞型，即PCV3a和PCV3b，與Ku[8]和Fux[12]等的分型一致。本研究獲得的毒株均為PCV3b基因型。

另外，湛洋等在疑似PDNS綜合征病料中檢測到PCV2、PCV3，并對PCV2和PCV3的Cap進行了研究，發(fā)現(xiàn)PCV2和PCV3的Cap蛋白結構及抗原性存在明顯差異，因此推測PCV2和PCV3間無交叉免疫保護特性[13]。因此加快對PCV3疫苗研究的步伐，對控制PCV3的流行是非常必要的。