不同中草藥提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌抑菌效果研究

劉承鑫，崔明全，顏本立，張輝華，王鶴佳，朱馨樂，劉燊，李秀梅，王健春，林樹茂*

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528231； 2.中國獸醫藥品監察所，北京 100081；3.廣東奔源科技發展有限公司，廣東 廣州 510650； 4. 天津市動物疫病預防控制中心，天津 300402)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種最為常見的人畜共患致病菌，能夠引起化膿性疾病或者毒素性疾病，若治療不及時容易導致人和動物的死亡[1]。在畜牧養殖過程中不規范的使用抗生素，使金黃色葡萄球菌耐藥性越來越強，耐藥基因的攜帶比例越來越多，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)是一種對人類乃至動物感染性疾病治療具有潛在威脅的耐藥病原菌，在我國流行范圍廣泛，攜帶率高于亞洲其他國家[2]。金黃色葡萄球菌在肉制品和奶制品中最為常見，容冬麗等[3]檢測了我國15個代表城市的部分即食食品和蔬菜樣品，其中發現9.3 %的監測樣品中檢出金黃色葡萄球菌，其中鹵肉的污染率最高，為16.3 %，其次是烤肉，蔬菜的污染率最低。金黃色葡萄球菌感染，除了食物源感染以外，人體自身攜帶也是常見的一個感染途徑，Moustafa El-Shenawy等[4]發現38 %的人的皮膚都攜帶金黃色葡萄球菌，而攜帶者中有37 %的金黃色葡萄球菌腸毒素基因陽性，王登峰[5]發現，采集牛的臨床和隱形乳腺炎奶樣中金黃色葡萄球菌的分離率大多在30～50 %，而隨機采集的泌乳牛乳頭混合奶樣中金黃色葡萄球菌的分離率在30% 左右。這也意味著金黃色葡萄球菌感染均威脅著人和動物的健康。

我國使用中草藥具有悠久的歷史，在人醫方面，中醫占據了世界醫學的重要地位；在畜禽生產上，中草藥所具有的營養作用、治療作用、保健作用等促進著畜禽行業的不斷進步。在畜禽生產上有提高生產性能，提高動物抗氧化能力等，近年不斷有研究已經證實，中草藥同樣具有良好的抑菌效果，成為有希望替代抗生素的抑菌劑[6]。為了有效治療金黃色葡萄球菌所引起的感染、能更好的應對細菌對抗生素耐藥性、治療過程中藥物的高劑量使用等突出問題，本實驗選擇7種不同粉碎粒度的中草藥提取物，檢測了對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，并選擇其中抑菌效果最好的中草藥對MRSA進行抑菌實驗，為金黃色葡萄球菌中草藥抑菌劑的篩選研究和中草藥不同粉碎粒度對抑菌效果研究提供理論基礎。

1 材 料

菌株與試劑：金黃色葡萄球菌ATCC25923由中國獸醫藥品監察所提供，金黃色葡萄球菌臨床菌株(11株)分別在不同地區(廣東省3株、山東省3株、青海省1株、浙江省1株、湖南省1株、四川省1株、上海市1株)動物中采集；其中1株來源于雞糞，2株來源于豬糞，其余來源于牛奶。不同粉碎粒度(粗粒度組為100目左右，細粒度組為1000目左右)的厚樸、木香、藿香、茵陳、川穹、白術、杜仲由廣東奔源科技發展有限公司提供；細菌DNA提取試劑盒、PCR 擴增試劑盒、引物、DNA分子量Marker均購自天根生化科技(北京)有限公司；青霉素、阿莫西林、頭孢西丁、苯唑西林、頭孢噻呋購自英國OXOID公司。

2 方 法

2.1 細菌的培養與稀釋 將金黃色葡萄球菌接種普通瓊脂培養基，35 ℃孵育24 h，挑取2～4個特征菌落用無菌生理鹽水校正至0.5 麥氏比濁單位，使其含菌量為1～1.5×108CFU/mL左右，用MH肉湯稀釋成1～1.5×106CFU/mL，作為工作濃度。

2.2 中草藥提取液的制備 準確稱取樣品5 g，加入40 mL蒸餾水混勻，90 ℃水浴1 h后，先用4層紗布初步過濾，收集濾液后用0.22 μm的濾膜再一次過濾，收集濾液，濃縮至生藥濃度為0.5 g/mL的提取液。所得提取液放入4 ℃冰箱備用。

2.3 藥物抑菌濃度的測定 參考美國臨床實驗室標準委員會CLSI[7]所公布的標準，用微量肉湯稀釋法進行測定。在96孔板中每排1～12孔無菌加入MH肉湯100 μL，然后每排第1孔中加入藥液100 μL，吹打均勻后吸取100 μL轉移至第2孔，以此類推進行倍比稀釋至第10孔混勻后棄掉100 μL，1～11孔中每孔加入菌懸液100 μL，第11孔為陽性對照,第12孔加入100 μL藥液作陰性對照。將培養板置于35 ℃恒溫箱中培養18 h，取出判定結果，沒有細菌生長的最后一孔的藥物濃度為該中草藥提取物的最小抑菌濃度(MIC值)。

2.4 臨床MRSA的判斷

2.4.1 耐藥表型的鑒定： 按照2.3方法進行測定，參考CLSI[7]的判斷標準，應對苯唑西林耐藥。

2.4.2MecA基因檢測： 按細菌DNA提取試劑盒的步驟提取出DNA后，加入PCR反應體系，總體積為20 μL，PCR條件為：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min，30個循環后72 ℃延伸5 min，擴增產物用1.2 %瓊脂糖凝膠電泳分離。參照文獻[1]的方法，以DNA為模板，根據Louie[8]等報道分別擴增葡萄球菌屬16srRNA基因、nuc基因以及MecA基因來鑒定MRSA，引物詳見表1。

表1 MRSA的MecA基因的檢測引物信息

2.5 中草藥對金黃色葡萄球菌及其MRSA的抑菌效果測定 按照2.3方法進行。

3 結果與分析

3.1 金黃色葡萄球菌耐藥性測定結果 株金黃色葡萄球菌對常見抗生素的耐藥情況見表2。采用CLSI[7]判斷標準，11個菌株均對青霉素耐藥，9株對苯唑西林耐藥，10株對頭孢西丁耐藥，7株對阿莫西林耐藥，6株對頭孢噻呋耐藥，同時耐這5種藥的有5株。根據2.4.1耐苯唑西林菌株即為MRSA。同時ATCC25923對5種抗生素的耐藥情況均在其質控范圍內。

表2 11株金黃色葡萄球菌對常見β-內酰胺類抗生素耐藥情況

注：S：敏感；M：中介；R：耐藥

3.2MecA基因的鑒定結果 通過提取金黃色葡萄球菌臨床菌株的基因組，多重PCR的鑒定，結果11株金黃色葡萄球菌均攜帶MecA基因，詳見圖1。

圖1 MRSA的16s、MecA、nuc基因的檢測結果

3.3 不同粒度中草藥提取液對金黃色葡萄球菌ATCC25923質控菌株的抑菌效果 各中草藥提取液對金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC測定結果如表3所示。結果顯示，粗粒度中草藥提取液中厚樸為12.5 mg/mL，木香、茵陳、白術、杜仲都為25 mg/mL，藿香50 mg/mL。而該菌株對7種細粒度中草藥提取液的敏感程度為厚樸與木香都為12.5 mg/mL，茵陳、川穹、白術都為25 mg/mL，藿香為50 mg/mL。其中厚樸的抑菌效果最好。

3.4 不同粒度厚樸提取液對11株耐常見β-內酰胺類耐藥的金黃色葡萄球菌的抑菌效果 選擇對ATCC25923抑菌效果最好的厚樸，檢測對上述11株耐常見β-內酰胺類耐藥的金黃色葡萄球菌的MIC值。結果見表4。細粒度厚樸除了對5和8號菌的MIC為50和12.5 mg/mL以外，對其他耐藥菌株的MIC都為3.125 mg/mL，而粗粒度厚樸MIC比厚樸細粒度普遍偏大，在6.25-25 mg/mL。

注：“-”表示無抑菌效果

4 討 論

4.1 細菌在抗菌藥的壓力下獲得耐藥基因而產生耐藥性 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的DNA中產生編碼青霉素結合蛋白(PBP2a)的MecA基因，PBP2a能替代結合失活的PBPs發揮轉肽酶的功能，促進細胞壁合成，從而產生耐藥性[9-10]。在本試驗中所有的被檢菌株均含有MecA基因，其中2株菌株(9和10號菌)對苯唑西林敏感和中敏。原因可能為表達MecA基因的輔助因子fem出現失活，導致對苯唑西林不耐藥[11]。試驗同時發現含有MecA基因的菌株不僅對苯唑西林有一定的耐藥性，對其他β-內酰胺類抗生素也有不同程度的耐藥，有可能是MecA基因的DNA片段中的SCCmec能獲取其他的耐藥基因，導致金黃色葡萄球菌對多種β-內酰胺類抗生素耐藥[12]。金黃色葡萄球菌多出現于乳制品，主要原因在于金黃色葡萄球菌易感染奶牛的乳房，導致乳制品中含有金黃色葡萄球菌。在本試驗中的11株MRSA中大部分也從牛奶中分離，但仍有部分在雞糞與豬糞中分離，這說明金黃色葡萄球菌可以通過其他畜禽攜帶傳播來誘導易感動物感染。萬古霉素是目前治療MRSA最重要的藥物，但是日本和美國都已經發現了對萬古霉素不敏感的MRSA，且有研究發現，帶有抗萬古霉素的質粒在一定條件下可以轉入MRSA，可以預測到，這種轉染也可能在動物的機體內實現，這也意味著尋找新的抗MRSA的抗菌藥是必要的[13]。

4.2 中草藥在我國醫學歷史中占據重要的地位，長期以來學者們積累了大量有關中草藥使用方式、使用劑量、配伍禁忌等經驗，廣泛的應用在各個領域。隨著對中草藥研究的不斷深入，越來越多的中草藥及其活性成分被發掘利用。本研究通過提取厚樸、木香、藿香、茵陳、川穹、白術、杜仲7種中草藥各兩種不同粒度的水溶性成分，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性進行了研究；選用效果最好的厚樸，觀察對MRSA的抑菌效果。試驗結果表明，不同粒度的中草藥下的提取液效果不盡相同，其中厚樸的綜合效果最好，木香、茵陳、白術效果次之。細粒度的厚樸提取液的效果要比粗粒度的厚樸提取液要好，這與李榮譽[14]等、王洪鳳[15]等的研究結果類似，其原因可能在于超微粉碎破壞中草藥細胞的細胞壁，使其有效成分更好的釋放，因此能減小藥材的粒徑,且分布逐漸均勻, 粒徑較小細顆粒比例顯著上升。同時,也使得藥材的主要營養成分或活性成分含量有所提高，因此能夠降低對MRSA的MIC，提高抑菌效果。超微粉碎技術能很好的解決中藥不能直接服用的問題，能提高藥物的吸收率，增強藥效，降低生產成本。但每種中草藥自身特性是不一樣的，有些中草藥不適合超微粉碎技術，需要通過加強基礎研究、根據藥材特性和臨床情況來確定不同中草藥的最適粒度[16-17]。該實驗對今后研究更多的不同粒度、種類或者不同的配伍的中草藥的抑菌效果，開發中草藥抗菌劑提供參考。