實驗動物糞便中金黃色葡萄球菌和沙門菌檢驗方法的比較

王秀麗，辛凌翔，李建，張一幟，李俊平，張媛

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，可寄生于牛、豬、兔、雞和人等。在實驗動物中，家兔最為敏感，豚鼠、大鼠、小鼠也可感染發病[1]。沙門菌為革蘭氏陰性桿菌，可以引起多種動物的腸道感染，因此沙門菌病又稱“副傷寒”或“腸道病”[2]。金黃色葡萄球菌和沙門菌檢驗是實驗動物糞便微生物檢驗、化妝品微生物檢驗、食品微生物檢驗中的重要檢驗參數，對實驗動物和人類健康均具有十分重要的公共衛生學意義。兩種菌的傳統檢驗主要靠細菌的形態、培養特性、生化特性、血清學特性等，方法繁瑣、耗時較長，且受檢驗人員能力和經驗等因素的影響。隨著分子生物學技術研究的深入和發展，PCR指紋圖譜、核酸雜交、16S rRNA序列分析、脈沖場凝膠電泳等技術也逐漸在細菌鑒定中應用。本研究結合現代化的生化鑒定儀器及分子生物學方法，比較了不同方法鑒定結果的準確性，并制定了本實驗室微生物鑒定程序。

1 材料與方法

1.1 樣品 含金黃色葡萄球菌和沙門菌的糞便盲樣，編號為0041、0065、0110、0179、0194，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 培養基及試劑 SS瓊脂平板、Baird-Parker平板、馬丁瓊脂血平板、凍干兔血漿、革蘭氏染色試劑盒均購自青島海博生物技術有限公司；馬丁肉湯、普通肉湯購自北京中海生物科技有限公司；裂解血細胞全血由中國獸醫藥品監察所細菌制品檢測室制備；健康牛血清購自gibco公司；27F和1492R引物合成及PCR產物測序由華大基因完成；PCR 2×buffer mix購自TaKaRa；ATB ID32E腸桿菌科和其他革蘭氏陰性桿菌鑒定試紙條、Staph葡萄球菌和微球菌鑒定試紙條購自生物梅里埃法國股份有限公司。

1.3 細菌分離純化及形態檢查 將糞便樣品分別用生理鹽水溶解后，用接種環挑取少量菌液劃線接種含0.4% 裂解血細胞全血和10% 血清的馬丁瓊脂平板，37 ℃培養24 h，觀察是否純粹生長，如果生長出形態不同的菌落，分別挑取單菌落劃線接種上述馬丁瓊脂平板，對純化的菌落分別革蘭氏染色，觀察細菌形態，同時將溶解后的糞便樣品接種含10% 血清的馬丁肉湯、普通肉湯，37 ℃培養18 h，觀察在液體培養基中的生長特性。

1.4 國標法 參考GB/T14926.14-2001金黃色葡萄球菌檢測方法[3]，將樣品接種于高鹽甘露醇培養基，37 ℃培養18～24 h，挑取1 mm左右、黃色且周邊培養基由紅變黃的菌落接種血瓊脂平板，37 ℃培養18～24 h，形成白色或者金黃色不透明、表面光滑、周圍有β容血環的菌落，且甘露醇發酵試驗和血漿凝固酶試驗陽性的，即可判定為金黃色葡萄球菌。參考GB/T14926.1-2001沙門菌檢測法[4]，將樣品接種于SS培養基，挑取可疑菌落接種KI、H2S、靛基質、尿素，賴氨酸脫羧培養基，37 ℃培養18～24 h，再結合革蘭氏染色及血凝試驗綜合判定。

1.5 生化試紙條鑒定法 按照1.3項的方法純化出樣品中含有的細菌并進行細菌形態檢查，用ATB ID32E生化鑒定試紙條對革蘭氏陰性桿菌進行生化鑒定，用Staph生化鑒定試紙條對革蘭氏陽性菌進行生化鑒定。

1.6 16S rRNA序列分析法 將按照1.3項純化的菌落用細菌16S rRNA的通用引物27F和1492R擴增，PCR反應程序為98 ℃ 1 min，98 ℃ 10 s，56 ℃10 s，72 ℃ 2 min，30個循環后72 ℃ 10 min，將擴增片段測序，在GenBank中比對，確定細菌類別。

1.7 鑒別檢驗 根據金黃色葡萄球菌有耐高鹽及在BP平板上的特殊的菌落形態，將樣品接種于含7.5% NaCl的肉湯培養基，37 ℃ 170 r/min振蕩培養24 h，同時將樣品接種于BP瓊脂平板，37 ℃培養24 h，可以篩選金黃色葡萄球菌[5]。

2 結果與分析

2.1 細菌分離純化及形態檢查 結果見表1。經檢定，編號為0110的樣品和0179的樣品中均有2種不同形態的細生長，編號為0041、0065、0194的樣品均純粹生長，為一種細菌，0065樣品在加入10%血清的馬丁肉湯生長后沉淀到試管底部，上層培養基澄清，在普通肉湯中均勻混濁生長。

表1 樣品中細菌分離純化及細菌形態檢查結果

2.2 生化鑒定 表2結果顯示，0041、0065、0110-1、0110-2、0179-1、0179-2、0194樣品的鑒定結論均為好或極好，結果可信。

2.3 16S rRNA序列分析 將分離純化的細菌分別擴增16S rRNA序列，均擴增出大小約1500 bp的條帶，經測序比對，樣品中含有的細菌類別見表3。

表2 生化鑒定結果

2.4 國標法 金黃色葡萄球菌的檢測根據國家標準的方案鑒定結果見表4。沙門菌的檢測根據國標的方法所有的樣品在SS培養基上生長均未長出無色半透明的菌落，因此未進行下去。

表3 16S rRNA序列比對結果

表4 金黃色葡萄球菌的檢測結果

2.5 鑒別檢驗 5份樣品在7.5% NaCl肉湯培養基中37 ℃ 170 r/min培養16 h后無菌生長，延長培養至24 h，菌液均勻混濁，挑取菌液劃線接種高鹽甘露醇培養基，0041和0110樣品生長出黃色圓形菌落，0065、0194和0179樣品均生長出黃色水滴狀的菌落，經鑒定，黃色水滴狀菌落為地衣芽孢桿菌，說明樣品中的金黃色葡萄球菌在高鹽肉湯培養基中不生長。將樣品按照1.3項純化后經革蘭氏染色陽性球菌接種Baird-Parker平板，結果顯示0065和0110樣品中的灰白色菌落和0179樣品中的革蘭氏陽性球菌為圓形、光滑、凸起、濕潤、灰色或黑色、周圍有渾濁帶，在其外層有一透明帶，符合大部分金黃色葡萄球菌的特征。0110樣品中黃色菌落接種Baird-Parker培養基后菌落形態為黑色光滑菌落，周邊無不透明圈，結果見表5。

表5 鑒別檢驗結果

3.6 檢驗結果報告 根據國家標準檢測，用生化檢定試紙條檢測和16S rRNA序列分析法檢測樣品中金黃色葡萄球菌和沙門菌的結果見表6。國家標準的方法無法將0194樣品中的沙門菌檢測出，也無法將0110樣品中的金黃色葡萄球菌檢測出。

表6 3種檢測方法檢驗結果比較

3 討論與結論

中國食品藥品檢定研究院組織的能力驗證項目——實驗動物糞便中金黃色葡萄球菌和沙門菌的檢驗，不限定方法，提供的作業指導書為實驗動物糞便中微生物檢測國家標準(2001年)。本檢驗參考國家標準存在以下問題：沙門菌和在SS培養基上生長的形態為粉紅色菌落，與國家標準描述的無色半透明菌落不一致；0110樣品中的金黃色葡萄球菌不凝固兔血漿。根據國家標準判定不能準確檢出樣品中的細菌。文獻報道的可用于金黃色葡萄球菌鑒別檢驗的培養特性，如耐高鹽、血漿凝固酶陽性或在Baird-Parker平板上生長特性，是大部分而不是全部金黃色葡萄球菌具有的特性，不含血漿凝固酶的金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗陰性，不分解脂肪的金黃色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的生長形態為圓形、光滑、凸起、濕潤、黑色、周圍有渾濁帶，在其外層有一透明帶[1，5]。

隨著科學技術的不斷發展，新的微生物鑒定技術也不斷出現，尤其分子生物學的方法的不斷發展，其快速、準確的優勢不斷得到認可，如化妝品出入境檢疫的行業標準中已應用PCR方法[6]。另外生化鑒定結合儀器及數據庫的應用，也能為細菌的鑒定提供科學有效的方法[7]。本研究的數據可以為化妝品中微生物檢驗、食品中微生物和實驗動物清潔度控制的國家標準和行業標準的修訂提供參考數據。

供樣單位制備樣品的糞便為SPF大鼠的糞便，糞便未經滅菌處理，在糞便中添加沙門菌、金黃色葡萄球菌、木糖葡萄球菌及摩根菌等制備而成。樣品0110中未添加金黃色葡萄球菌，而本實驗室檢出的金黃色葡萄球菌可能為大鼠糞便中本身攜帶的金黃色葡萄球菌，因此其細菌特性與添加的金黃色葡萄球菌的特性不一致，本結果與供樣單位對留存樣品再測結果一致。

本試驗總結出的檢驗方法如下：首先將樣品溶解后接種營養成分比較豐富的馬丁瓊脂平板(含0.1%裂解血和10%健康動物血清)，將樣品中含有的菌盡量全部培養起來，觀察菌落形態，判定樣品中的細菌是否純粹，如果有一種以上不同形態的菌，分別挑取不同形態的菌劃線接種平板，純化培養后對細菌分別進行鑒定。先對純化的細菌進行革蘭氏染色，觀察細菌形態，如果為革蘭氏陰性桿菌則用ATB ID32E試紙條進行生化鑒定，如果為革蘭氏陽性球菌，則選擇Staph試紙條進行生化鑒定，或者對純化出的菌用27F和1492R引物對擴增細菌的16S rRNA，擴增出的序列與GenBank中的序列比對，即可得知細菌的屬種。該檢驗方法較簡單快速準確可行。