去細胞基質水凝膠的治療研究進展

黎 婷，張海燕

(蕪湖職業技術學院生物工程學院，安徽蕪湖 241003)

0 引言

目前，去細胞支架越來越多的應用到了組織工程中，如骨損傷、糖尿病潰瘍等外科臨床手術中，來源于人皮膚、豬小腸粘膜下層和膀胱等組織器官的去細胞基質水凝膠[1]，已被用于組織修復材料，如心肌衰弱、肝臟、氣管和食管等器官的修復[2-4].去細胞基質可通過2種常用方法制備可注射的水凝膠：一種方法是將去細胞基質研磨成粉末，用液體溶解后進行注射，例如骨基質、膀胱基質等[5]，這種方法應用較少；另一種方法是利用胰酶等消化基質，消化后的基質可自動形成納米纖維水凝膠，與體內pH等生理條件更為匹配，相比第一種方法更具臨床應用優勢[6]，還可以與生長因子等聯合應用，更作為生物墨水材料應用于組織的3D打印[7]，該方法制備的去細胞基質水凝膠應用更為廣泛.

1 器官修復作用

1.1 心肌

去細胞基質水凝膠在心臟疾病中主要用于心肌梗塞，如豬心基質水凝膠已用于臨床心肌梗塞患者的治療，通過重構心臟特殊的心肌細胞微環境來吸引內源細胞遷移來幫助修復.這種心臟基質水凝膠還可以用于血液相容性組織的修復，由于使用酶消化制備的水凝膠含有大量的膠原成分[8]，通過激活血小板起到激動劑的作用[9].這種治療方式可大大提高心肌增殖、新血管形成，從而修復心臟功能[10].越來越多的研究致力于探明修復機制，如Wawwenaar等將大鼠心肌梗塞使用水凝膠治療進行RNA全轉錄組分析，發現在心臟修復相關通路中，如血管生成、心臟轉錄等因子顯著上調，而炎癥、細胞凋亡和纖維化等因子顯著下調，刺激心肌生成[11].

制備水凝膠的組織器官來源中，豬、山羊和人等不同來源的心肌已在體外實驗中證實其可使用性，而豬小腸粘膜下層、人胎盤及豬和人的心包由于無組織特異性，作為自體同源組織材料，已分別應用于豬和人的體內實驗[[12-13]，結果顯示梗死面積顯著縮小[14].去細胞基質水凝膠也已經用于心臟組織的3D打印，使用人心肌祖細胞作為種子細胞，證實了新血管發生，移植到裸鼠的心肌梗塞模型后，心臟功能顯著增強[15].在大鼠心肌梗塞模型中，心包去細胞基質水凝膠與生長因子，如bFGF和HGF聯用治療，實驗結果顯示小動脈發生數顯著增加，新生成的血管與原有血管發生吻合，實現通血[16].綜上所述，在心臟疾病治療中應用去細胞基質水凝膠，可促進細胞增殖和遷移，新血管生成，心臟功能顯著改善.

1.2 運動器官

1.2.1 骨骼肌 骨骼肌常發生急性損傷，或因外周動脈疾病造成缺血性損傷和萎縮，多種不同來源器官的去細胞基質水凝膠已用于骨骼肌的修復研究.在大鼠后肢缺血性損傷模型中，使用豬骨骼肌與人臍帶去細胞基質水凝膠進行注射治療，二者內皮細胞增殖、動脈生成、肌細胞增殖及骨骼肌祖細胞遷移等均顯著增加，但在肌纖維形態學上，前者要優于后者[17-18].在大鼠腹壁肌肉缺損模型中，使用豬真皮去細胞基質水凝膠與聚合材料通過電噴射技術在靜電紡紗材料上凝膠化，移植于缺損部位4周后，經過力學分析發現修復部位硬度幾乎達到天然組織硬度，移植部位經HE染色，顯示大量巨噬細胞和肌動蛋白陽性細胞遷移[19]；與使用膀胱去細胞基質水凝膠治療對比，后者降解更快，肌發生更顯著[20].

1.2.2 肌腱 肌腱和韌帶損傷會引起組織撕裂和運動功能障礙，注射水凝膠在二者治療中效果良好，如Farnebo使用人肌腱去細胞基質水凝膠進行肌內注射，引起纖維原細胞、脂肪干細胞及巨噬細胞大量增殖[21].由于肌腱通血功能差，在大鼠肌腱損傷模型中，單獨使用水凝膠進行注射治療4周后，并未形成肌腱，但是添加富血小板血漿及脂肪干細胞后，形成肌腱，且力學測定，如彈性系數等效果好[22].由于人肌腱供體有限，目前選擇豬和馬作為異種肌腱供體[23]，體外實驗顯示經過凍干處理后，細胞增殖率和細胞活性更高[24].

1.2.3 關節軟骨 關節軟骨再生能力差，目前常使用微裂縫手術促使軟骨再生，但是臨床效果差強人意.可注射水凝膠結合種子干細胞或者生長因子聯用成為一種可替代的方法，Kwon首次使用豬軟骨去細胞水凝膠用于大鼠軟骨損傷的注射治療[25]，多個研究使用不同物種的軟骨去細胞水凝膠進行了體外實驗，以期獲得最好的細胞反應和力學特性，如去細胞過程和酶消化過度會造成水凝膠力學脆弱，重塑能力差[26-27].

1.2.4 骨 缺乏血液供應和相關的生長因子造成骨折后不愈合或愈合效果差，去細胞基質水凝膠注射在骨折區域可傳遞外源性生長因子，或招募內源性生長因子[28].制備骨去細胞基質水凝膠時需通過鹽酸處理脫鈣，否則水凝膠無法凝膠化[29].研究發現，注射水凝膠修復骨折時，聯用人骨基質細胞與骨形態蛋白2，骨基質形成和膠原沉積增加，而不同的種子細胞和生長因子的修復效果有所差別[30].

1.3 神經組織

1.3.1 腦 缺血或外傷造成的皮質損傷會分別引起缺血性或者創傷性腦損傷，均可使用水凝膠注射進行治療.DeQuach首先使用豬腦制備水凝膠培養神經元[31]，Bible開始了水凝膠聯合神經干細胞注射治療大鼠中風模型的體內研究，但是核磁共振結果顯示并沒有形成神經纖維以及與神經網絡中其它細胞的連接[32].分別使用膀胱、臍帶與腦去細胞基質水凝膠聯合間充質干細胞注射治療中風性腦損傷，結果顯示水凝膠濃度高于3 mg/mL，在體內才會凝膠化，而濃度為8 mg/mL時，內生性修復效果最好；不同器官去細胞基質水凝膠均會促使間充質干細胞向神經干細胞的分化，以及內源性細胞向損傷區域的遷移；在腦損傷區域的修復程度上，不同器官制備的去細胞基質水凝膠并不是關鍵，腦組織特異性細胞(如神經干細胞)才是功能恢復的關鍵[33-34].

1.3.2 脊髓 脊髓損傷會導致損傷平面下喪失感覺和運動功能，水凝膠治療旨在愈合脊髓缺口，形成新的神經連接.已有研究報道了多種豬脊髓去細胞基質水凝膠的制備方法和體外研究結果，顯示出其促進神經元的增殖、遷移和分化，以及神經元突起的形成[35].豬脊髓和膀胱去細胞基質水凝膠在大鼠脊髓損傷模型的修復應用中，細胞增殖、遷移和分化無顯著差異，與人間充質干細胞聯用治療，血管生成和神經元突起形成的結果也無顯著差異，但是以上實驗中水凝膠都迅速分解[36].在今后水凝膠修復脊髓損傷的研究中，更傾向于對水凝膠進行更好的修飾以期減少分解，以及選擇更理想的種子細胞.

綜上所述，在多種器官修復的研究中，如肝[37]、結腸[38]、肺[39]、胰腺[40]等器官，相較于目前的其它臨床生物材料，水凝膠與受體微環境更為匹配，種子細胞的增殖、遷移及分化及也更為顯著.

2 移植條件

2.1 組織來源

不同組織制備的可注射基質水凝膠成分有所差別，這種差別尤以影響水凝膠的機械性能以及擴展性，組織主要選自于異種動物，尤其是豬源或牛源，來源于人活體的捐獻非常少，大多數來自死者的捐獻[41].同種及異種組織來源的對比研究發現，活體異種組織機械性能更好；自體同源組織，如心包和大網膜等組織由于取樣時手術創口大而量少，并沒有實際應用價值；異體同源組織常來自于病體，制備水凝膠難度加大，而水凝膠的粘多糖和膠原成分與來自于正常機體組織的有顯著差別[22,42].因此，目前在臨床使用的去細胞基質水凝膠，多是來源于異種動物組織的生物商品.

2.2 供體年齡

供體年齡越大，去細胞基質水凝膠注射后的凝膠化狀態越差，脂肪沉積和纖維化加劇.Sood等團隊發現，使用不同年齡組織制備的水凝膠體外培養神經元與人間充質干細胞，年齡越小，神經元增殖、突觸聯系、神經網絡形成的狀態越好，間充質干細胞增殖和分化狀態越好[43-44].因此，在制備去細胞基質水凝膠時，應選擇年齡小的供體器官組織，在組織工程的應用中效果更好，如一些動物的胚胎組織已有應用.

2.3 組織特異性

不同組織基質的結構和組成有一定的差異，形成每種組織獨特的微環境和生化功能，經過去細胞處理仍然保留一定的組織特異性成分，包括標記蛋白、生長因子和組織結構.French團隊發現與脂肪等組織基質相比，心臟基質中心肌祖細胞表達的早期心肌標記蛋白含量有顯著性差異[45]；Viswanath團隊使用脊髓、骨骼和牙基質體外培養間充質干細胞，在脊髓基質中培養的間充質干細胞向舌乳頭分化的數量更多[46].因此在組織工程的應用中，應選擇結構更匹配的組織，是因基質誘導種子干細胞向組織特異性細胞系分化潛力更大.

2.4 滅菌

目前基質水凝膠的滅菌技術和無菌狀態并沒有統一衡量標準，去細胞步驟主要包含去除細胞成分(洗滌劑或酶處理)、酸處理和滅菌(抗體、射線處理[47]).最終的滅菌處理步驟會顯著影響基質支架的機械性能，對乙烯、γ射線和電輻射進行無菌處理比較，機械性能有顯著差別，乙烯處理優于電輻射及γ射線[48].今后組織工程中基質水凝膠的研究，需要探索全新的滅菌方式，保證其體內應用生物活性的保留.

3 可能的修復機制

去細胞基質是從組織或器官制備的天然支架，去除細胞和細胞核成分，但是保留了組織或器官的三維空間結構(仍然保留了部分膠原纖維等天然纖維成分)；支架具有生物活性和生物相容性，相對于用于進行自體或異體移植的其它人工生物工程材料，去細胞基質展現了沒有免疫排斥的優勢；研究發現，去細胞基質水凝膠中保留了大量的細胞生長因子，如成纖維生長因子、轉化生長因子和肝細胞生長因子等，可以吸引種子細胞的生長、遷移、增殖和分化，以及血管發生。這種與種子細胞之間的“實時互動”，可以更好的重塑組織、器官的結構，對組織與器官的再生與功能修復有著重要的意義[1].

4 展望

已有的研究結果已證實去細胞基質水凝膠作為支架在多種器官損傷治療的修復作用，表現在促進細胞增殖、遷移與新血管生成等方面，但是修復機制尚未明確.去細胞基質水凝膠的應用剛起步，仍有許多的研究空間.在再生醫學中，伴隨著去細胞基質水凝膠的選擇、制備方法和修飾等條件的日益成熟，以及修復機制的深入闡釋，將更加完善其在器官功能的修復治療效果.尤其是新技術如3D打印的出現，會越來越適應器官的復雜性，而結合理想的種子細胞及生長因子，器官功能的修復也會日益加強，為再生醫學的發展提供了新的方向.