抗生素相關性腹瀉病原菌的檢測方法

王 碩，張志華

(承德醫學院附屬醫院 血液科，河北 承德 067000)

廣譜抗生素的使用可消滅患者機體的大多數致病菌，但同時也嚴重破壞了腸道微生態平衡，引發菌群失調甚至二重感染[1-3]，近年對于艱難梭菌相關性腹瀉(Clostridiumdifficile-associated diarrhea,CDAD)研究較多，CDAD約占抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)的1/3，但仍有2/3病原菌尚不明確，導致AAD的診斷及治療仍是臨床的一個難題，因此對于抗生素相關腹瀉的病原菌檢測十分重要，本文就抗生素相關腹瀉的檢測方法進行綜述。

1 AAD的危險因素

研究提示，幾乎所有的抗生素均能引起AAD，既往流行病學研究顯示導致AAD的危險因素包括：廣譜抗生素的應用、患者本身免疫力低下、化療藥物的使用、應用質子泵抑制劑、年齡≥65歲、住院時間長等[4-7]，應注意臨床預防。

2 AAD的發生機制和分類

AAD的病理生理學發生機制包括分泌性、動力性、滲出性、滲透性等，臨床常按照感染性AAD和非感染性AAD進行分類。

2.1感染性AAD 目前，感染性AAD的原因主要是廣譜抗生素的使用導致腸道菌群失衡，致病菌或條件致病菌大量生長繁殖，導致不同嚴重程度的腹瀉，AAD的病原微生物包括艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、金黃色葡葡萄球菌、克雷伯桿菌、念珠菌、沙門菌[8]以及無毒梭菌等[9]，CDAD產生腸毒素A和細胞毒素B(分別與tcdA和tcdB基因相關)，臨床上，艱難梭菌的表現范圍很廣，從無癥狀的攜帶到嚴重的、危及生命的暴發性偽膜性腸炎和中毒性巨結腸[10]。

2.2非感染性AAD 非感染性AAD又稱功能性AAD，其原因主要為：(1)一方面抗生素可增加胃腸動力引起腹瀉，另一方面抗生素的不良反應可引起腸黏膜損害和腸上皮萎縮，進而導致營養物質吸收障礙引起腹瀉；(2)抗生素引起腸道正常菌群失調使得代謝功能受損，包括多糖類發酵障礙、糖吸收不良，最終腸內滲透壓升高引起滲透性腹瀉[11]。

3 AAD的實驗室檢查

3.1糞便常規的檢測 大便常規檢測對AAD缺乏特異性，對于腹瀉較輕的患者的糞便檢測可無異常，而較嚴重患者檢測也只能出現白細胞或紅細胞。

3.2便菌群比例 糞便涂片的革蘭染色法不僅能直接觀察出腸道內菌群數是否產生變化，還能觀察出革蘭陽性菌與陰性菌的比例及球菌與桿菌的比例是否失調，或有無真菌，由此判斷腸道菌群紊亂程度，該方法實用、可靠、經濟，可快速對臨床下一步治療提供依據指導治療。

3.3腸道細菌定量培養法 通過不同培養基的菌落培養，以期對菌數進行計數，對于CDAD的培養，多采用CCFA選擇性培養基，但培養陽性率低，而且不能區分產毒性菌株和非產毒性菌株，該方法主要用于流行病學研究，很少用于臨床診斷。近年來采用瓊脂顯色選擇性培養基，比CCFA培養基選擇性好，艱難梭菌培養陽性率增加了20%，目前仍需大量的研究證實其在臨床中的應用價值[12]；毒力生成培養(TC)是在選擇性培養艱難梭菌的基礎上發展起來的，主要分為2部分，即艱難梭菌培養和毒素檢測，通過觀察毒素引起的細胞病變和加入中和毒素判斷有無產毒菌株，由于TC檢測需要時間長，使艱難梭菌感染診斷延遲，另一方面，體外菌株的產毒能力能否準確代表該菌株在體內的情況尚需進一步研究[13]。由于培養方法操作起來耗時多并且腸道菌群種類培養的局限性，因此目前不能將該法用于AAD的診斷。

3.4細胞毒性中和試驗(CCTA) CCTA通過檢測糞便中毒素B進行診斷，通過觀察引起的細胞病變，然后通過特異性抗血清中和試驗確定細胞病變的特異性[14]，具有特異度、靈敏度較高等優點，曾認為是艱難梭菌感染檢測的“金標準”，但該實驗的糞便標本需為新鮮糞便，如果糞便放置太久導致毒力減退可引起假陰性結果，另外，該技術要求高、花費時間長，尚未得到廣泛應用。

3.5谷氨酸脫氫酶(GDH)實驗 糞便GDH檢測方法靈敏度高，特異度中等，出結果快，價格便宜，操作簡單，在臨床實驗室易于執行，但GDH是艱難梭菌菌株表面的一種共同抗原，產毒性和非產毒性艱難梭菌菌株都可產生，不能區分產毒性和非產毒性艱難梭菌,需要聯合毒素測試來診斷艱難梭菌感染[15]，GDH陰性樣本可排除，GDH陽性樣本仍需要進行毒素測試來確定。

3.6競爭性酶免疫分析(EIA)毒素檢測 EIA毒素檢測是最早應用于艱難梭菌感染臨床檢測的方法，具有操作簡單、出結果快、價格便宜、特異度高等優點，但因靈敏度較低在臨床診斷中價值有限。EIA檢測毒素的靈敏度約為45%。與艱難梭菌培養相比，EIA檢測毒素靈敏度及陽性預測值較低，可能造成輕中度艱難梭菌感染漏診，而且不能對毒素基因和核糖體型進一步分析。綜上，結合GDH的兩步法和三步法可提高CDAD診斷的準確率[16]。

3.7核苷酸擴增檢測(NAAT) 實驗室常用的NAAT檢測方法包括常規聚合酶鏈反應(PCR)、實時PCR、環介導恒溫擴增法(LAMP)。NAAT靈敏度和特異度均較高，并且操作簡單、出結果快，但價格較毒素EIA較貴。與GDH檢測和EIA毒素測試比較，NAAT能更快、更準確診斷艱難梭菌感染。然而，僅可檢測具有產毒素潛能的艱難梭菌毒素基因，而不是直接檢測艱難梭菌毒素，因此檢測結果會出現假陽性[17]。

3.8結腸鏡檢測 結腸鏡檢查對絕大部分AAD無特異性，僅可以發現假膜性腸炎(PMC)患者結腸的特異性病變即結直腸黏膜上可見2～10 mm微黃色的斑塊，文獻[18]報道,PMC與抗菌藥物的使用相關，即便結腸鏡檢查是鑒別PMC的最佳方法，但該操作可能增加感染和腸穿孔風險。

3.9實時熒光定量PCR 1992年Higuchi等首次采用動態PCR和封閉式檢測方法對目的核酸數量進行實時分析，最初是將熒光計和PCR儀連接，在反應管中加入與雙聯DNA分子結合而發射熒光的燃料，在PCR擴增過程中，隨擴增產物不斷增加，與擴增產物結合的染料所產生的熒光也不斷增強，可通過熒光計檢測到的熒光強度估算擴增產物量，目前實時熒光定量PCR所使用的熒光化學方法主要有熒光探針TaqMan、熒光探針-分子信標、熒光染料-SYBRGreen、熒光引物LUX等，隨著分子生物學技術的發展,實時熒光定量PCR法因其簡便快捷、可定量、重復性好、靈敏度高、特異度高及PCR反應后不需要電泳檢測等優點,廣泛應用于遺傳性疾病的診斷、腫瘤分子的診斷、病原體檢測，由于完全閉管操作，可以克服PCR反應過程中污染造成假陽性結果，可用于檢測復雜微生物環境，目前已成為腸道微生態研究中重要的分子生物學技術方法之一，李芬[19]通過比較實時熒光定量PCR法與常規細菌鑒定法檢測腸道致病菌的對比研究中發現實時熒光定量PCR的陽性率更高，另一方面PCR技術避免了細菌接種培養-生化鑒定-血清學鑒定的不足，其主要針對細菌DNA進行檢測，該方法被國內外學者廣泛應用于追蹤、檢測細菌性腹瀉，為臨床早期診斷和治療提供了依據[20]，雖然該技術受到檢測范圍的限制(僅限于細菌或真菌甚至更有限的范圍，取決于所用的引物)以及靈敏度的影響[21]，不利于我們更加深入的了解AAD，但在一定程度上有利于我們指導臨床治療。

3.10基于宏基因組的二代測序技術(metagenomic next-generation sequencing,mNGS) 目前，上述檢查方法無法全面、具體分析AAD的腸道菌群，mNGS應運而生，近十年來，世界各國啟動“人類微生物計劃”和“地球微生物組計劃”，2015年10月，美國科學家在Science呼吁實施“聯合微生物研究計劃(UMI)”，與此同時，我國科學家聯合美、德兩國科學家在Nature提出成立“國際基因組計劃”，得益于mNGS的發展，我們可以更全面的了解微生物群落特點，該技術的原理是將DNA(cDNA)隨機片段化、加接頭，制備測序文庫，通過對文庫進行延伸反應，檢測相應的信號從而獲取文庫信息，具體實驗流程包括樣品的準備、DNA的提取和檢測、PCR的擴增及產物純化、文庫制備和庫檢、Miseq測序。mNGS是目前常用的測序技術，以illumina公司的Soiesa為代表，因其能夠檢測標本中存在的所有DNA或RNA，故而能夠分析患者標本的整個微生物組以及人宿主基因組及轉錄組，所以被廣泛應用于微生物的研究，例如腸道微生態中物種多樣性和豐富度的菌群分析[22]，mNGS首次用于感染性疾病的診斷報道于2014年關于1例中樞神經系統鉤端螺旋體病患者的臨床診斷,基于mNGS的臨床診斷指導抗生素的使用從而使患者最終恢復健康，該病歷首次證明了mNGS可以為臨床診斷提供依據[23]，此后不斷有個案報道，劉桂等[24]通過二代基因測序技術成功分析應用中藥湯劑葛根芩連湯后對2型糖尿病患者腸道菌群變化的影響。Nobel等[25]通過mNGS研究發現幼年小鼠應用抗生素后對腸道菌群、機體生長和代謝產生影響，進而研究兒童早期應用抗生素對機體的影響，目前，越來越多mNGS提供的數據被廣泛應用于臨床，mNGS可以對包括病毒、細菌、真菌或寄生蟲等多種病原體檢測，根據DNA和(或)RNA序列直接對糞便標本進行鑒定[26]，具有絕對的優勢，mNGS的另外一個關鍵優勢是測序數據可以對除了致病病原體之外的潛在病原體進行分析，例如微生物組特征和通過RNA測序的轉錄組分析對人類宿主反應的平行分析，以預測感染原因和評估疾病風險[27-28]。盡管如此，mNGS仍面臨巨大的挑戰，尤其對于免疫功能低下患者，因其潛在病原體范圍更廣，故無法區分污染物、定植菌及致病菌，導致最終的診斷結果必須依靠于臨床，而且，mNGS目前缺乏通用參考標準及臨床測定質量保證，此外，限制其臨床應用的因素還包括成本、報銷等。盡管目前該技術存在很多局限性，但將來mNGS必將成為AAD診斷的關鍵驅動因素，從而推進臨床診斷及精準醫療的發展。

綜上，臨床上雖然可以利用各類益生菌制劑預防和治療AAD，但治療效果一般，而且前期診斷的方法還尚不完善，需要更加深入地認識腸道菌群與AAD的關系從而尋找靈敏度、特異性較高的診斷方法。