同源重組修復(fù)蛋白R(shí)AD54B在腫瘤中的研究進(jìn)展

邱世岳

腫瘤的發(fā)生與DNA損傷密切相關(guān)，DNA損傷的積累會(huì)導(dǎo)致原癌基因的激活和抑癌基因的失活。外源性因素(電離輻射)和內(nèi)源性因素(炎癥)可以產(chǎn)生多種類型的DNA損傷，包括堿基的修飾、DNA鏈的交聯(lián)、單鏈及雙鏈斷裂。而在DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks, DSBs)是最嚴(yán)重的損傷形式。DSBs的錯(cuò)誤修復(fù)會(huì)引起基因組不穩(wěn)定，從而導(dǎo)致重大的染色體重排或斷裂位點(diǎn)突變，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤發(fā)生。同源重組修復(fù)(homologous recombination repair, HRR)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞最為精確的DNA損傷修復(fù)方式，而RAD54B蛋白是該通路重要的組成成分，該蛋白能保障損傷的DNA得到精確的修復(fù)，從而減少相關(guān)疾病或腫瘤的發(fā)生。基于HRR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的重要性，而RAD54B在該通路中有不可或缺的作用，該文通過(guò)回顧性分析近年文獻(xiàn)探討RAD54B與腫瘤的關(guān)系。

1 RAD54B發(fā)現(xiàn)的起源及結(jié)構(gòu)

Hiramoto等[1]在1999年首次報(bào)道SNF2超家族的一個(gè)新成員，即RAD54B基因。該基因與RAD54基因高度同源，其編碼的蛋白在睪丸和脾臟中高表達(dá)，并且在減數(shù)分裂和有絲分裂重組中有著重要的作用。RAD54B基因位于人染色體8q21.3-q22區(qū)域。人原發(fā)性淋巴瘤和結(jié)腸癌中存在RAD54B基因高度保守位置的純合突變，這提示RAD54B基因突變也許參與了腫瘤的發(fā)生。RAD54B編碼的mRNA長(zhǎng)度為3 074 kb，經(jīng)過(guò)翻譯和修飾后的蛋白質(zhì)包含910個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量為10.3×104[2]。RAD54B蛋白中心區(qū)域的特征性解旋酶模體與RAD54的SNF2/SWI2家族蛋白高度同源，而氨基末端則僅前10個(gè)氨基酸具有同源性[3]。RAD54B蛋白包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域，(1)N末端區(qū)域：SWI2/SNF2家族結(jié)構(gòu)域(aa 299-598)，該區(qū)域是ATP酶結(jié)構(gòu)域的組成部分，能水解ATP釋放能量，進(jìn)而破壞蛋白質(zhì)-DNA的相互作用[4-5]；(2)RAD54B的中央?yún)^(qū)域：為DEAD樣解旋酶(DEXDc)結(jié)構(gòu)域(aa321-462)，主要參與依賴于ATP的DNA重塑；(3)C末端區(qū)域：解旋酶超家族(HELICc)結(jié)構(gòu)域(aa 636-766)，該結(jié)構(gòu)域能利用來(lái)自核苷酸三磷酸水解的能量驅(qū)動(dòng)蛋白沿著DNA移位[2]。此外，RAD54B還有5個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)和3個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)與產(chǎn)生能量的水解反應(yīng)密切相關(guān)。

2 RAD54B參與DSBs修復(fù)功能

RAD54B在HRR通路上與RAD54的功能相似，RAD54B與RAD51、RAD54及BRCA1形成蛋白復(fù)合體，進(jìn)而調(diào)節(jié)RAD51蛋白介導(dǎo)的同源DNA鏈配對(duì)和同源DNA鏈入侵[6-8]。RAD54B蛋白在HRR的功能如下：(1)RAD54B蛋白是雙鏈DNA依賴性ATP酶；(2)RAD54B蛋白具有DNA移位酶和DNA解旋酶活性；(3)RAD54B蛋白與RAD51蛋白相互作用，這種相互作用是具有功能性和高度特異性的；(4)RAD51蛋白刺激RAD54B蛋白的ATP酶活性，DNA轉(zhuǎn)位酶活性和DNA解旋酶活性。相反，RAD54B蛋白刺激由RAD51蛋白參與的D環(huán)(同源重組中的關(guān)鍵中間體)的形成[9]。總而言之，RAD54B蛋白的主要功能是使用ATP水解產(chǎn)生的能量重塑蛋白質(zhì)-雙鏈DNA復(fù)合物，從而增強(qiáng)染色質(zhì)的可近性。也有研究表明，同源重組時(shí)，在DSBs位點(diǎn)處的單鏈DNA(ssDNA)會(huì)形成核蛋白絲，而RAD54B蛋白可以穩(wěn)定該核蛋白絲，從而刺激DMC1介導(dǎo)的DNA鏈交換[10]。事實(shí)上，由于精確的DSBs修復(fù)需要以染色質(zhì)為模板，所以依賴于RAD54B蛋白的染色質(zhì)重塑活性對(duì)HRR至關(guān)重要。

3 RAD54B與腫瘤的研究進(jìn)展

3.1 RAD54B在腫瘤細(xì)胞系的研究進(jìn)展有研究證實(shí)，HRR通路中RAD51、BRCA1等蛋白與乳腺、消化道腫瘤的發(fā)生及預(yù)后密切相關(guān)[11-12]。自從發(fā)現(xiàn)RAD54B參與DSBs修復(fù)以來(lái)，學(xué)者們不斷探索RAD54B與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。至少在12種不同類型癌癥中檢測(cè)到RAD54B拷貝數(shù)變異(擴(kuò)增和缺失)，單核苷酸多態(tài)性(錯(cuò)義和無(wú)義)以及mRNA表達(dá)變化，這提示RAD54B基因和蛋白的改變與腫瘤的發(fā)生相關(guān)[13]。Wesoly等[14]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAD54B缺陷鼠胚胎干細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性比對(duì)照組高1.5倍，這表明RAD54B有助于維持基因組的穩(wěn)定性。基于細(xì)胞中RAD54B蛋白表達(dá)缺陷會(huì)降低染色體靶向整合的報(bào)道，人們對(duì)RAD54B蛋白在HHR通路中的潛在作用有了初步了解。

有研究發(fā)現(xiàn)，敲除或敲低細(xì)胞中RAD54B表達(dá)能誘導(dǎo)染色體不穩(wěn)定(CIN)，而在RAD54B缺陷細(xì)胞中重新引入RAD54B則減少了CIN(非整倍體)，這表明RAD54B缺失可能是癌癥發(fā)生、發(fā)展的致病事件[15-17]。也有研究發(fā)現(xiàn)ATM和RAD54的失活并未增加細(xì)胞對(duì)紅外線照射的敏感性，而ATM、RAD54和RAD54B的三突變體則表現(xiàn)出顯著的紅外超敏反應(yīng)[18]。暴露于不同的染色體斷裂劑中，RAD54/RAD54B缺陷細(xì)胞具有更高敏感性，并且其突變頻率比野生型鼠胚胎成纖維細(xì)胞和精原細(xì)胞的突變頻率高[19-20]。McAndrew等[21]通過(guò)對(duì)不同腫瘤測(cè)序結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，在人乳腺癌、肝癌和膀胱癌等癌癥組織中，存在不同頻率和不同類型的RAD54B基因的有害變異。上述研究結(jié)果表明，RAD54B在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到一定的作用。

3.2 RAD54B在腫瘤組織的研究進(jìn)展

3.2.1結(jié)直腸癌 Sajesh等[22]通過(guò)siRNA沉默和化學(xué)抑制SOD1的方式來(lái)選擇性殺死RAD54B缺陷的HCT116細(xì)胞，并進(jìn)一步證實(shí)這種相互作用在不相關(guān)的細(xì)胞類型中是保守的，而抑制SOD1后產(chǎn)生的DSBs在RAD54B缺陷細(xì)胞中持續(xù)存在并且導(dǎo)致細(xì)胞死亡。盡管只有3.3%的散發(fā)性結(jié)直腸癌有RAD54B基因的體細(xì)胞突變，但該基因的突變或缺失在淋巴瘤、腎、前列腺、腦和乳腺癌中也同樣存在。因此，作者認(rèn)為抑制SOD1也許可以治療RAD54B缺陷的其他類型腫瘤。

Nagai等[23]在108例Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)，與RAD54B蛋白低表達(dá)組相比，RAD54B蛋白高表達(dá)組患者的遠(yuǎn)期無(wú)復(fù)發(fā)生存率更低。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型的多變量分析表明，RAD54B蛋白高表達(dá)是Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。RAD51也是HRR通路中的關(guān)鍵成分，其表達(dá)與癌癥的預(yù)后關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。有文獻(xiàn)報(bào)道RAD51過(guò)表達(dá)與各種癌癥的不良預(yù)后相關(guān)，如肺非小細(xì)胞癌、乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等。但在另外兩份研究中卻有著相反的結(jié)論，顯示在膠質(zhì)瘤和乳腺癌中，RAD51高表達(dá)則有著較好的預(yù)后。作者在結(jié)直腸癌的研究中也分析了RAD51表達(dá)，盡管RAD51在癌組織中的表達(dá)高于正常黏膜，但結(jié)果顯示RAD51的表達(dá)模式并不能預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后。作者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與先前的研究結(jié)果相矛盾，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)方法不同所致。在該實(shí)驗(yàn)中作者采用的是Real-time PCR法檢測(cè)RAD51表達(dá)，而以往多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用的是免疫組化法。另外，RAD54B和RAD51的表達(dá)與結(jié)直腸癌患者的臨床預(yù)后不一致，可能是HRR以外的其他通路導(dǎo)致的，因?yàn)镽AD54B除參與HRR通路，其還可以通過(guò)MDM2-MDMX泛素連接酶復(fù)合物來(lái)增加p53蛋白的降解。由于實(shí)驗(yàn)的局限性，RAD54B在結(jié)直腸癌中的臨床用途仍有待進(jìn)一步探討。

3.2.2肺腺癌 Hwang等[24]使用免疫組化法在93例肺腺癌中對(duì)24對(duì)配對(duì)基因進(jìn)行研究，并應(yīng)用Kaplan-Meier分析和Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型來(lái)評(píng)估它們的預(yù)后作用。結(jié)果顯示，在預(yù)后不良的肺腺癌患者中，只有FEN1蛋白和RAD54B蛋白高表達(dá)，并且FEN1蛋白和RAD54B蛋白同時(shí)表達(dá)的患者容易出現(xiàn)晚期淋巴結(jié)受累和預(yù)后不良。上述結(jié)果提示，對(duì)于同時(shí)表達(dá)FEN1和RAD54B的患者，加強(qiáng)隨訪和靶向治療可能會(huì)改善患者的臨床預(yù)后。在24對(duì)預(yù)測(cè)的合成致死基因?qū)χ校珻hang等[25]通過(guò)免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)了四種表達(dá)模式可以作為131例亞洲肺腺癌患者的不良預(yù)后標(biāo)記。這四種表達(dá)模式分別是RAD54B表達(dá)上調(diào)，BRCA1表達(dá)下調(diào)同時(shí)RAD54B表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)EN1表達(dá)上調(diào)或不變且RAD54B表達(dá)上調(diào)，PARP1和RAD54B同時(shí)表達(dá)上調(diào)。除了BRCA1表達(dá)下調(diào)同時(shí)RAD54B表達(dá)上調(diào)的這一預(yù)后標(biāo)記外，其余3個(gè)預(yù)后標(biāo)記在3個(gè)獨(dú)立的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中均得到了進(jìn)一步證實(shí)。

Xu等[26]通過(guò)對(duì)15例肺腺癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常肺組織行Real-time PCR、免疫組化和Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAD54B在癌組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁正常肺組織。與此同時(shí)，通過(guò)向肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549轉(zhuǎn)導(dǎo)攜帶shRAD54B的慢病毒，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組RAD54B表達(dá)顯著減少。抑制A549的RAD54B表達(dá)能減少細(xì)胞增殖、降低Caspase 3/7的活性以及促進(jìn)該細(xì)胞的凋亡。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RAD54B在肺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮著致癌作用。

由于研究的樣本量、病例來(lái)源以及患者隨訪期等的局限性，RAD54B等蛋白表達(dá)對(duì)肺腺癌生存率的長(zhǎng)期影響尚不清楚。因此，今后還需進(jìn)一步更完整的研究來(lái)驗(yàn)證RAD54B表達(dá)與肺腺癌臨床預(yù)后及靶向治療之間的關(guān)系。

3.2.3肝癌 Wang等[27]研究發(fā)現(xiàn)，相較于正常肝細(xì)胞系LO2，RAD54B在肝癌細(xì)胞系中有更高的表達(dá)。同樣的，在肝癌組織中，RAD54B蛋白高表達(dá)也許與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。另外，RAD54B蛋白表達(dá)下調(diào)能顯著抑制細(xì)胞增殖和群落形成，并且能誘導(dǎo)G1/S細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果提示，RAD54B有致癌特性，同時(shí)也可能是肝癌患者的潛在治療靶點(diǎn)。

3.2.4乳腺癌 Zhang等[28]通過(guò)對(duì)多個(gè)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的生物信息學(xué)分析以及通過(guò)免疫組化和乳腺癌細(xì)胞系等相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探討乳腺癌中RAD54B的表達(dá)情況及其與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中RAD54B蛋白表達(dá)高于癌旁正常組織。在Luminal A型乳腺癌中，RAD54B高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。并且，在細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)RAD54B過(guò)表達(dá)能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，而RAD54B表達(dá)下調(diào)則會(huì)抑制該亞型乳腺癌的生長(zhǎng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RAD54B表達(dá)或許可以為L(zhǎng)uminal A型乳腺癌患者提供精準(zhǔn)的激素治療方案。

上述研究雖然未能闡明RAD54B參與癌癥形成的機(jī)制，但這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，RAD54B有可能作為臨床上用于治療癌癥的新靶標(biāo)。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，HRR作為DSBs最為精確的修復(fù)方式，能高度維持DNA的保真度，因此，正常的HRR對(duì)于維持細(xì)胞乃至機(jī)體生理功能至關(guān)重要。在HRR的關(guān)鍵步驟中，RAD54B蛋白作為RAD51蛋白的輔助因子，能協(xié)助RAD51蛋白介導(dǎo)的DNA鏈入侵，所以RAD54B蛋白表達(dá)異常會(huì)影響斷裂DNA鏈的修復(fù)，進(jìn)而影響基因組的穩(wěn)定性。因此檢測(cè)癌組織中的RAD54B蛋白表達(dá)，對(duì)于了解該腫瘤的癌變機(jī)制和對(duì)腫瘤的預(yù)后判斷及治療方案有參考價(jià)值。