骨髓來源細胞在眼部新生血管形成中的研究進展

呂 洋,蔣 華,曹 虹，曹 娟,李 靜,劉占宏，李 紅

眼部新生血管常導致嚴重視力喪失[1-2]。近年來，有研究表明除原位細胞，骨髓來源細胞(bone marrow derived cells， BMCs)對眼部新生血管的形成有重要作用[3]。BMCs參與眼部新生血管的機制非常復雜，通過多種因素刺激、多種細胞和因子參與以及多條信號通路調控。本文總結已知BMCs在眼部新生血管，尤其是在角膜新生血管、視網膜新生血管和脈絡新生血管中的作用和主要機制，以及影響BMCs作用的風險因素，綜述如下。

1BMCs和眼部新生血管

眾所周知，新生血管形成包括2個主要方式：血管發生和血管生成[4]。大量實驗室研究表明，BMCs可分化為多種干細胞和單核巨噬細胞，在角膜、視網膜和脈絡膜中發揮重要作用[5]。內皮祖細胞(endothelial precursor cells， EPCs)、造血干細胞(hematopoietic stem cells， HSCs)和間充質干細胞(mesenchymal stem cells， MSCs)[4]可分化成血管成分[血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)、周細胞和內皮細胞(endothelial cells， ECs)]以及血管外細胞[肌成纖維細胞、炎性細胞、視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial， RPE)細胞和神經膠質細胞][3]。除干細胞之外，骨髓(bone marrow， BM)來源的單核巨噬細胞可分泌多種血管生成因子刺激基質細胞衍生因子1(stromal derived factor 1， SDF-1)在RPE細胞的表達，參與BMCs遷移及黏附到局部缺血或損傷的組織[5]。提示BMCs不僅可特異性地在眼部新生血管處聚集、增殖和分化為多種細胞等構成血管壁的成分，而且還可分泌多種促血管生成因子如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)、轉化生長因子(transforming growth factor， TGF)和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor， bFGF)等參與新生血管的生成[1,5]。

1.1BMCs和角膜新生血管(corneal neovascularization， CV) 角膜是無血管組織，一些炎癥性疾病、傳染性疾病和外傷被認為與CV有關，CV可通過不同的方法人工誘導，如輔助手術致術源性角膜損傷新生血管形成和堿燒傷誘導實驗性CV等[6]。有研究顯示炎癥性CV的老鼠模型中，CD11b陽性的BMCs參與基底膜與細胞外基質(extracellular matrix， ECM)的裂解，引起該處血管內皮細胞(vascular endothelial cells， VEC)分裂增殖形成幼芽，繼而生成新生血管。提示BMCs參與炎癥性CV[7]。此外，將bFGF的緩釋劑植入角膜板層囊袋中，也可以誘導CV。CV中>90%的BMCs分化的周細胞可表達CD45和CD11b[6-7]。另有研究顯示17.7%的VEC和53%的周細胞是源于CV中的BMCs，而BMCs在CV初始階段即到達新生血管處。提示BMCs在CV早期就起到關鍵作用，如果在早期進行干預，那么對于CV的預后將起到重要作用。

1.2BMCs和視網膜新生血管(retinal neovascularization， RNV) RNV是增生性血管病的主要并發癥，如糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy， DR)和早產兒視網膜病變。視網膜局部缺血或損害是RNV的主要特點，Grant等[8]研究表明BM中HSCs能分化成所有參與RNV發病機制的造血細胞系，在缺血性病變區聚集。另一項研究也證實了視網膜受損后，BMCs靶向黏附于星形膠質細胞，表現出典型的ECs外觀和特點[9]。此外，在激光損傷模型和氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy， OIR)模型[10]中RPE細胞分泌大量的SDF-1參與BMCs遷移和黏附。在手術切除DR患者的視網膜前膜中有大量表達CD133+EPCs和CD14+白細胞，這意味著BMCs參與到了RNV中。

1.3BMCs和脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization， CNV) CNV是多種眼部疾病所共有的病理體征。大量臨床標本和動物模型研究表明CNV中有BMCs的參與。老年黃斑變性患者手術切除的CNV膜中，發現了AC133陽性細胞標記的EPCs和HSCs[11]。特發性CNV和病理性近視相關CNV的形成均與干細胞的活動有關[12]。CNV中表達的BMCs明顯高于眼部其他組織，提示BMCs可特異性在CNV區富集，參與血管形成[1]。其前期研究也表明，CNV中BMCs分化為血管細胞沿新生血管的管腔分布，激光誘導小鼠CNV初期即可觀察到大量的BMCs聚集，觀察BMCs參與CNV動態的全過程，發現CNV后第7天病損區BMCs數量達高峰，隨后緩慢下降，到1月余BMCs數量趨于平穩[1]。而BM中的單核巨噬細胞從造模后早期第7天起就持續存在于病損區及眼部其他組織中。用特異性內皮細胞標志物CD31染色，發現大量的CD31聚集在此。提示CNV區域內的BMCs可能分化為VEC參與血管的形成[1]。此外，CNV區域還有血管平滑肌細胞的標志物，如α-平滑肌激動蛋白、結合蛋白、NG2硫酸軟骨素黏蛋白或單核巨噬細胞標記物F4/80[13]，提示CNV區域中BMCs還可以分化為VEC、VSMCs和單核巨噬細胞等來參與血管的生成。

2 BMCs對眼部新生血管調節機制

眼部新生血管中BMCs分布的比例和作用時間是不同的，但他們也有一些相似之處。例如它們參與眼部新生血管的發育，均包括4個步驟：動員、遷移、黏附和分化，在這一過程中受到多種細胞因子和信號通路的調控。

2.1BMCs在眼部新生血管中的動員 當機體在缺氧或受到各種損傷等因素的刺激下，BMCs會加速趨化至損傷部位，參與局部組織缺血損傷的發生[14]。BMCs可通過分泌VEGF，發揮對BMCs的動員作用。使BM微環境從靜態轉變為激活狀態，同時VEGF的升高也帶動BMCs活化加速，粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor， G-CSF)和促紅細胞生成素(erythropoietin， EPO)水平也開始增加。此外，SDF-1和其特異性受體CXCR4結合可以加強BMCs的活化作用，內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase， eNOS)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMP)9在促進BMCs的動員過程中發揮重要的作用。

G-CSF通過對細胞本身和BM環境的調控起到動員作用[15]。其可通過影響HSCs的表達，減少HSCs的凋亡，從而使BM環境中ECs黏附分子的表達下降，增加基質金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases， MMPs)釋放和ECM降解，促進BMCs移行到BM外[15]。此外，也有報告稱G-CSF減少了BM中血管內皮細胞黏附分子的表達，刺激了MMPs的釋放和ECM的退化。在CV中，G-CSF表達的增強促進了EPCs從BM進入血液循環[6-7,16]。

EPO可以刺激BM中EPCs生成。有研究發現，心肌梗死心力衰竭時，EPO水平上升，增加了周圍血液的EPCs數量[17-18]。另有研究顯示，OIR小鼠模型中顯示無血管區域EPO水平被抑制。提示早期使用EPO可以防止缺氧誘導的視網膜神經元凋亡，而晚期使用EPO則會促進新生血管的生成，加速視網膜神經元的凋亡。這表明EPO在BMCs參與血管生成開始時，就進入RNV中發揮動員和募集的作用[19]。

2.2BMCs在眼部新生血管中的遷移 VEGF、SDF-1、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)和MMPs在調節BMCs的遷移過程中起到了重要作用，但具體的分子機制較為復雜，現尚未研究清楚。

趨化因子和它們的受體在BMCs遷移過程中起到了重要作用。如VEGF和其趨化因子VEGF-A；SDF-1和趨化因子CXCR4和CX3CR1。事實上，SDF-1和VEGF之間及CXCR4和VEGF之間呈正相關關系。也就是說，一種因子表達上調，另一種因子也會相應增高。此外，在腫瘤相關的研究中，發現SDF-1和VEGF協同，可誘導BM來源細胞的遷移[20]。

在RNV和CNV模型中，SDF-1和CXCR4可誘導EPCs、HSCs和MSCs聚集于眼部新生血管區域，而CXCE4拮抗劑會明顯減少BMCs的聚集[5,20]。在低氧誘導的RNV模型中，RPE層中缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1， HIF-1)與SDF-1相互作用、相互影響，從而促進更多的BMCs遷移到眼部參與新生血管形成。

TNF-α作為一種特異性的炎性因子表達于炎性組織中。在CV的研究中發現，TNF-α缺失后更多的單核巨噬細胞侵入到炎癥部位，增強了眼部新生血管管腔的形成及角膜瘢痕的形成[21]。另一項研究證明了在BM源性炎性細胞中選擇性表達的TNF-α受體1b，誘導信號正向調節炎性細胞侵入，促進CNV中的血管生成[21]。

MMPs在調節BMCs的遷移過程中起到了重要作用。眼部組織分泌多種酶類物質，如MMP-2、MMP-7、MMP-9及MMP-13等參與細胞的移行，降解細胞外基質，促進新生血管出芽，從而促進BMCs趨化遷移至新生血管部位[22]。CNV發生過程中，TGF和VEGF表達上調，引起MMPs表達增高，而基質金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase 1， TIMP-1)增加的不明顯，破壞了MMPs與TIMP-1之間的平衡，增加了ECM的裂解，促進了BMCs的移行，VEC增生及管腔的形成。

2.3BMCs在眼部新生血管中的黏附 BMCs的黏附主要是通過血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)、細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管內皮細胞鈣黏蛋白、SDF-1和整合素來調節。多種黏附因子與相應配體結合，介導BMCs的黏附過程。BMCs在CNV上大量分布，多種因子如VCAM-1和ICAM-1的表達明顯增高[10]。提示這些黏附因子在BMCs參與眼部新生血管黏附中發揮重要作用。在CNV模型中，整合素與多種細胞因子VEGF、血小板衍生生長因子、bFGF及MMPs等，介導BMCs向細胞間和ECM的移行、黏附。而整合素拮抗劑可抑制VEC與ECM的黏附，進而阻止VEC移行和增生，目前已成為臨床上重要的新生血管抑制劑之一。

2.4BMCs在眼部新生血管中的分化 大多數BMCs在到達眼部新生血管區域后分化為ECs、VSMCs和單核巨噬細胞。一些在穿過玻璃膜疣之前，到達脈絡膜血管內時就已經完成了分化。有研究表明，在角膜、視神經盤和沒有新生血管的虹膜中也發現了一些BMCs；有些表現出樹枝狀且F4/80陽性，表明眼部的BMCs除了對眼部新生血管的作用，還有其他功能[1]。

不同的微環境誘導了BMCs向不同方向分化，而BMCs在眼部新生血管中的作用現仍未闡明。在新生小鼠視網膜神經元的微環境中，BMCs被誘導分化為多種細胞因子以及參與未知信號通路[9-10,12]。此外，在RNV和視網膜退化疾病中，移植到視網膜下腔靜脈的BMCs分化成為血管ECs和感光細胞，對血管的發育和神經元的保護有著很大的影響[23]。

近期研究發現Notch信號不僅能抑制或刺激尖端細胞的形成，也能影響EPCs的活化、增生和分化[24-25]。有研究表明，在缺血性新生血管中，Notch信號Jagged-1，調節Notch信號來刺激EPCs向ECs分化，增強了新生血管的生成[25]。而CNV的小鼠模型研究表明，Notch受體的轉錄因子下游重組細胞結合蛋白-Jκ的缺乏，是通過調節EPCs分化為ECs誘導了血管損傷，提示轉錄因子下游重組細胞結合蛋白-Jκ介導Notch信號可能在一定程度上通過影響EPCs分化，參與了眼部血管穩態的維持[25-27]。

3 BMCs對眼部新生血管微小RNA(miRNA)作用

miRNA可以調節BMCs的生理功能，在骨髓干細胞中特異性的表達[1，28]，改變干或祖細胞的性質，可明顯升高或降低miRNA的表達[1]。項陽和姜明紅[29]利用小鼠實驗，證明了在脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)誘導炎癥狀態下，miRNA-146a表達失常導致單核巨噬細胞功能紊亂。

我們研究小組建立嵌合體小鼠CNV模型后發現，BMCs對CNV生成時MMP-2/MMP-13的迅速上調起主要作用。同時證實了CNV中BMCs內miR188-5p的表達亦隨時間變化。通過雙酶報告基因實驗證實miRNA-188-5p可能是MMP-2和MMP-13的靶基因[12]。研究miRNA-188-5p的作用及其與CNV中BMCs MMP-2和MMP-13的關系，發現miRNA-188-5p可能會通過調控ECM中色素上皮衍生因子的降解，從而調節MMP-2和MMP-13表達，VEC增生、移行、凋亡及CNV纖維化，從而影響CNV的嚴重程度。另外，還發現在嵌合體小鼠CNV模型中，BMCs對CNV生成時SDF-1和CXCR4的迅速上調起主要作用[12]。

4 影響BMCs作用于眼部新生血管風險因素

一些新生血管疾病的風險因素如衰老、吸煙、高血糖及炎癥等往往會改變BM的微環境，影響BMCs參與新生血管發生和發展。眼部新生血管風險因素對眼部新生血管有一定作用，尤其是對CNV。

4.1衰老 年齡是增加CNV發病的重要因素[1]。有研究表明，高齡CNV小鼠較低齡CNV小鼠的CNV體積、面積明顯增多，且BMCs分化的血管平滑肌細胞明顯增多。此外，該研究還發現高齡CNV小鼠較低齡CNV小鼠BMCs分化的VEC數量則無明顯增減[2]。近期我們的實驗室使用體內生物熒光成像，也表明了衰老的BMCs使得CNV更加嚴重[12]。

4.2吸煙 吸煙是老年黃斑變性中最重要的風險因素，能促進BMCs參與CNV的發育。有學者在小鼠CNV模型中發現香煙中微顆粒主要成分尼古丁會增加CNV的嚴重程度[20]。一項研究也表明了尼古丁可通過VSMCs中乙酰膽堿受體的調節誘導VEGF釋放，此過程是由表皮生長因子受體胞外信號調節激酶通路調節[30]。另有研究也表明尼古丁促進了BMCs到CNV中的聚集、趨化并對BMCs分化有影響，是通過VEGF、bFGF和血管內皮細胞黏附因子1的上調來影響的[20,30]。表明尼古丁對BMCs在CNV作用的間接影響，可能是通過其他因素調節的。然而未來還需要進行更多關于機制的研究。

4.3高血糖 高血糖也被認為是眼部新生血管和視力喪失的風險因素。DR是20～74歲美國人群中視力喪失的最普遍原因。有研究發現小鼠CNV模型中有大量BMCs聚集于損傷處，并證明了患有糖尿病的小鼠中BMCs更多地聚集到CNV處[31]。ECs標記和單核巨噬細胞標記的BMCs比例上升，VEGF和CNV中SDF-1因子上調。此外，將MSCs轉移到人RPE細胞中，VEGF與SDF-1的表達在高血糖時增加[31]。提示高血糖增強了RPE細胞中VEGF和SDF-1的表達，促進了BMCs的聚集，影響CNV中BMCs的分化，增加了糖尿病小鼠CNV的嚴重程度。另有研究顯示，高血糖誘導的氧化應激促進了STAT3的活性，使VEGF轉錄活化，從而間接促進了BMCs參與CNV，加重CNV的嚴重程度[32]。

4.4炎癥 BMCs上表達大量炎性介質，且炎癥在CNV中起到重要的作用[33]。有研究表明，單核巨噬細胞缺損的基因敲除鼠行激光誘導CNV后，損傷部位有大量來源于BM的單核巨噬細胞聚集，且分析后發現基因敲除組的CNV面積、體積、厚度較對照組有明顯減少[26]。提示炎性介質在BMCs參與眼部新生血管的發生和發展中有重要作用[34]。此外，有研究表明中性粒細胞及T淋巴細胞在CNV中同樣發揮著重要作用[26,34]。

總之，大量證據表明BMCs在眼部新生血管發病機制中起到了關鍵作用[35]，分為動員、遷移、黏附和分化4步。多種細胞因子如SDF-1、TNF-α、VEGF及MMPs等可用于BMCs的靶向治療。BMCs參與眼部新生血管的風險因素對預防眼部新生血管的發生起到重要作用。對BMCs參與眼部新生血管機制的深入理解，有助于探討靶向優化的治療方案。本文詳細綜述了BMCs在眼部新生血管發育中的重要作用，涉及到抗血管內皮生長因子以及未來抗血管生成療法。然而，眼部新生血管的退化，如RNV和CNV，幾乎不會是永久的，若沒有抗血管內皮生長因子抑制劑的多重使用，幾個月后會觀察到新血管的再生[35-36]。至今，極少有研究調查過眼部新生血管復發時BMCs作用潛在的功能和機制。如果能解決這個問題，可能對BMCs結合抗血管生成治療靶向治療有幫助。此外，眼部新生血管的診斷常常建立在新生血管形成之后，有時甚至伴隨著分泌物和出血。BMCs從BM活化并轉移至周圍血液循環，在新生血管形成前就到達損傷處。這些研究使我們猜測BMCs和相關細胞因子是否能作為潛在標志，來協助眼部新生血管的早期診斷。目前許多相關發病機制仍需更進一步研究。總的來說，帶著這些問題能更深刻地幫助我們提高對眼部新生血管中BMCs影響的潛在調節機制的理解，有望在未來擴大BMCs的臨床應用和治療用途。將BMCs作為靶點或載體不僅可應用到眼部，還可應用到身體其他部位。