PCR-DGGE技術檢測速凍餃子餡料中微生物區系

游新俠，賈慶超，劉曉華，張杰

（鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南鄭州450064）

速凍食品又稱急凍食品，是一種以低溫快速凍結方式生產的食品，是指在強冷的環境下，在15 min 左右完成凍結過程，使其在-18 ℃或更低溫度條件下貯藏運輸、長期保存的食品，能最大限度保持食品本身的色澤風味及營養成分，但是在生產、運輸和貯藏過程中微生物的生長繁殖，一直是困擾冷卻肉發展的關鍵問題之一[1]。速凍食品將成為世界上發展最快的食品，其銷售量在發達國家將占全部食品的60%～70%。隨著人民生活水平的提高，對食品的衛生、營養、保鮮和方便性等方面的追求，速凍食品的發展前景十分廣闊[2]。

速凍餃子的組成主要包括餡料和面皮兩部分。餡料組成較為復雜，可由肉類、禽類、蛋類、水產品、蔬菜及調味品等一種或多種配料為餡料。速凍餃子為生制品，比較適合微生物（尤其是腐敗菌和致病菌）的生長繁殖。在實際生產加工中，從生產車間到冷凍車間，從運輸到市場，再到消費者購買的整個過程，都會出現溫度的波動從而導致水餃中微生物的變化以致影響產品的品質[3]。因此，對速凍餃子冷凍前菌系結構的分析，為后續食品衛生安全的加工、保藏條件等提供參考。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

速凍餃子：市售。

1.2 儀器

SX500 滅菌鍋：日本 TOMY 公司；BCD-221 冰箱：河南新飛電器集團有限公司；DT200A 電子天平：江蘇常熟市長青儀器儀表廠；SW-C7-LCU 潔凈工作臺：博訊實業有限公司醫療設備廠；QL-861 漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DRP-9052 電熱恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；303A-2 電熱恒溫培養箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；EMF2116MS1 微波爐：合肥榮事達三洋電器股份有限公司；HYG-A 全溫搖瓶柜：太倉市豪成實驗儀器制造有限公司；Biometra PCR 儀：德國 Biometra 公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠；XRS+凝膠成像系統ChemiDoc：美國Bio-Rad 生命醫學產品有限公司；LX-200 迷你離心機：海門市其林貝爾儀器；NIKOU E100顯微鏡：北京冠普佳有限公司；MIKRO 22R 臺式離心機：德國Hettich 公司。

1.3 試劑

1.3.1 試劑

營養瓊脂培養基（BR）：北京陸橋技術有限責任公司；氯化鈉（AR）：鄭州化學試劑一廠；蛋白胨（BR）：上海市松江區香閔路；牛肉浸膏（BR）：上海市奶公司第九牧場；革蘭氏染色試劑盒（BR）：四川省邁克科技有限責任公司；2×Taq Master Mix（Dye）（AR）、DM2000 DNA Marker（AR）：北京康為世紀生物科技有限公司；6×Loading Buffer（AR）：北京寶日醫生物技術有限公司；瓊脂糖（AR）：美國英杰生命技術有限公司；冰凍無水乙醇（CP）：天津市富宇精細化工有限公司；EDTA（AR）：北京鵬彩精細化工有限公司；蛋白酶K（初始酶活30 U/mg）、溶菌酶（初始酶活 40 000 U/mg）：美國 Sigma公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris 飽和酚（AR）：北京索萊寶科技有限公司。

1.3.2 試液的配制

Tris-EDTA（TE）溶液：取 1 mol/L Tris-HCl 100 mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL，加入800 mL 去離子水混勻，定容后，高溫滅菌，20 ℃下保存備用；蛋白酶K：用無菌水稀釋至 20 mg/mL，-20 ℃冷存備用；SDS：制備10%SDS 溫水浴溶解后，調pH 值至7.2 備用；溶菌酶：50 mg/mL，-4 ℃冷存備用。

2 試驗方法

工藝流程：采樣-培養基的制備（平板、斜面培養基、液體培養基）-平板（菌株）序列編號-分離純化-平板計數-形態鑒定-DNA 提取-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增-凝膠電泳分析-16S rDNA 測序。

2.1 采樣

采樣地點：河南省鄭州市金水區；采樣時間：2018年 3 月 29 日；樣品分類：速凍米面制品；pH 值：6；采樣數量：10 個；樣品產地：河南省鄭州市。

2.2 平板序列編號

試驗主要平板編號見表1 所列。

表1 主要平板序列編號Table 1 Primary plate serial number

2.3 菌株序列編號

菌株編號說明：JHX 代表某品牌。梯度編號見表2。

表2 主要菌株序列編號統計Table 2 Major strain serial number statistics

2.4 DNA提取

將新鮮培養的菌液用小型臺式離心機離心10 min（12 000 r/min、4 ℃），離心后倒去上清，以收集菌體細胞[4]。加少量無菌水懸洗細胞，吸打沉淀菌體，分散菌體，再次離心 10 min（12 000 r/min、4 ℃），棄上清。加入334 μL TE Buffer 及 16 μL 溶菌酶，漩渦振蕩器混合均勻，放置37 ℃恒溫水浴鍋中1.5 h；加入100 μL 10%SDS上下顛倒搖動離心管；加入2.5 μL 濃度為20 mg/mL 的蛋白酶K，放置55 ℃水浴鍋中3 h 期間輕輕上下搖動離心管，使混合液充分混合）。加250 μL Tris 飽和酚（pH 8.0），輕輕上下顛倒 5 min，再加等體積 250 μL 氯仿，上下顛倒 5 min，離心 10 min（12 000 r/min、4 ℃）。用大口槍尖小心吸取上清液，移至干凈的離心管中。加無水冰凍乙醇，上下輕柔顛倒沉淀DNA，離心10 min（12 000 r/min、4 ℃），棄上清，將離心管中的 DNA 晾干后，加入 TE 溶液，放至 4 ℃冰箱中溶 24 h 備用[5-6]。

2.5 PCR擴增

用于PCR 擴增反應體系的試劑，如表3 所列。

表3 16S rDNA 的 PCR 擴增反應體系（總 25 μL）Table 3 PCR amplification reaction system of 16S rDNA（total 25 μL）

以提取DNA 為模板，對JHX-系列的16S rDNA基因進行PCR 擴增，通用引物使用27F 和1492R。引物序列 27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGTACCTTGTTACGACTT。

將溶好的DNA 吸打均勻，備用。按照用量，配置PCR 總體系，并按照每管 24 μL，分裝于 PCR 管中，再在每個PCR 管中加入1 μL 模板，每次擴增需要有一個陰性對照。設置PCR 儀的反應條件：預變性，94 ℃5 min；變性，94 ℃ 1 min，退火，55 ℃ 1 min；延伸，72 ℃90 s，30 個循環；72 ℃延伸 10 min，終止。PCR 結束后，取出各管，可放至-4 ℃暫存[7-10]。

2.6 凝膠電泳分析

將制好的1%瓊脂糖凝膠，加熱至沸，后在膠模中倒膠，放梳子，靜置20 min 凝固，凝固后，用移液槍先將loading buffer 每滴2 μL 滴在油紙上，將擴增的16S rDNA 按照順序點在loading buffer 中，然后用槍尖將混合液滴點在相應孔內。第一個位置上加入Marker（采用D2000）以用于對所得PCR 產物的分子量指示。電泳設備安裝完畢后，先用80 V，5 min 進行電泳，待樣品都已跑出孔后，將電壓調至180 V，20 min，當指示染料到達膠的2/3 處時，即可停止。把電泳膠放入溴化乙啶（EB）液體中染色約15 min，清水漂洗，放至紫外凝膠成像儀下觀察。如果在紫外儀下看到的是在1 500 bp處唯一一條明帶，且陰性正常，則可送交測序公司測序，否則需重新擴增[11-12]。

2.7 樣品菌株16S rDNA測序

將擴增成功PCR 產物，封口膜密封，送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，要求測序27F 端一個反應，約600 bp。

2.8 速凍餃子凍前菌株進化史分析

2.8.1 試驗材料菌株16S rDNA 序列

JHX 系列（共 30 株菌）：JHX-1，JHX-2，JHX-3，JHX-4，JHX-5，JHX-6，JHX-7，JHX-8，JHX-9，JHX-10，JHX-11，JHX-12，JHX-13，JHX-14，JHX-15，JHX-16，JHX-17，JHX-18A1，JHX-18A2，JHX-19，JHX-20，JHX -21，JHX -22，JHX -23，JHX -24A1，JHX -24A2，JHX-25，JHX-26，JHX-27，JHX-50。

2.8.2 Mega 6 軟件畫圖

菌株進化史序列樹繪圖專用軟件：Mega 6 軟件[13]。

2.8.3 比對分析方法與步驟

將所得30 株菌株按照門、綱、目、科、屬、種的分類方式將所有細菌分類。

3 結果與分析

3.1 凝膠電泳成像結果

把電泳膠放入溴化乙啶（EB）液體中染色約15 min，清水漂洗，放至紫外凝膠成像儀下觀察，結果如圖1所示。

圖1 16S rDNA 擴增凝膠成像圖譜Fig.1 16S rDNA amplification gel imaging

DNA Marker 由 100、250、500、750、1 000、2 000 bp大小的DNA 片段組成，試驗組都能夠看到明顯條帶，且主要集中在1 500 bp 附近，符合細菌DNA 片段大小，說明此次細菌DNA 片段擴增成功。

3.2 測序比對菌株歸屬結果

用Chromas 讀圖軟件讀圖，截取測序成功的有效序列片段，用于序列的比對分析。結果采用EzBioCloud軟件進行比對分析[14-16]，比對結果如表4 所列。

表4 JHX-系列菌株16S rDNA 序列比對分析結果Table 4 The blast results of 16S rDNA sequences of JHX-series strains

續表4 JHX-系列菌株16S rDNA 序列比對分析結果Continue table 4 The blast results of 16S rDNA sequences of JHX-series strains

3.3 菌株進化史分析結果

選擇具有代表性的6 個綱畫進化樹，且占總比例最高的γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）中的假單胞菌屬（Pseudomonas）作為代表，結果見圖2 所示。

3.4 樣品菌系結構和多樣性分析

分離菌株共33 株。其中28 株測得16S rDNA 27F端序列（JHX-1，JHX-2，JHX-3，JHX-4，JHX-5，JHX-6，JHX-7，JHX-8，JHX-9，JHX-10，JHX-11，JHX-12，JHX-13，JHX-14，JHX-15，JHX-16，JHX-17，JHX-18A1，JHX-18A2，JHX-19，JHX-20，JHX-21，JHX-22，JHX-23，JHX-24A1，JHX-24A2，JHX-25，JHX-26，JHX-27，JHX-50）。2 株測的全序列（JHX-23，JHX-25）（由于這 2 株菌比對的相似度較低，所以測通便于比對分析）。3 株死亡（JHX-51A1，JHX-51A2，JHX-52）（由于分離培養的過程中，細菌可能會受到外界污染、培養基、溫度等方面會影響細菌的生長能力）。

有效序列30 株菌中，有14 個屬，22 個種。其中得到 γ-變形菌綱 5 個屬，12 個種，共 19 株菌，占總數的63%，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）是占總數量最大的，放線菌和β-變形菌綱（Betaproteobacteria）數量居中，異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）數量最少。詳細細菌所歸門類統計見表5 所列。

從表5 可以得出，JHX-系列中，γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）中的假單胞菌屬數量最多，可以認為假單胞菌屬（Pseudomonas）為優勢菌群。β-變形菌綱3 個屬，3 個種，共3 株菌，占總數的10%。厚壁菌門1 個屬，2 個種，共2 株菌，占總數的6.7%。放線菌門2 個屬，3 個種，共3 株菌，占總數的 10 %。擬桿菌門2個屬，2 個種，共2 株菌，占總數的6.7%。異常球菌-棲熱菌門1 個屬，1 個種，共1 株菌，占總數的3%。

4 分析及討論

經過對上述代表性的細菌屬分析，可以基本上斷定，餃子餡料中的材料，受到過不同程度的污染，首先是假單胞菌屬（Pseudomonas）為優勢菌，說明餡料中的菜已經有一定程度的腐敗菜葉，沒有將腐敗的菜葉去除干凈，所以才會導致假單胞菌為優勢菌的原因。奈瑟菌屬（Neisseria）的生長環境及營養需求比較復雜，初步可以判定是人為衛生情況所導致的此類細菌屬。微桿菌屬（Microbacterium）的存在說明餡料中的菜被昆蟲爬過或生長過，沒有清洗干凈[17]。

通過進一步的分析，餃子的衛生情況，人員的衛生情況以及前處理的衛生情況有待提高。此次分離存活的30 株菌中，沒有分離到致病菌，但是不排除沒有致病菌的存在，因為本次實驗采用國標細菌總數檢測方法，選用NA 培養基，對致病菌的分離培養存在局限性，如沒有血液培養基，非動物適溫的37 ℃等。雖然本研究未分離培養到致病菌細胞，但不能判定該樣品中一定不存在致病菌。

圖2 JHX-系列假單胞菌屬（Pseudomonas）的種群結構和進化史分析Fig.2 Population structure and evolutionary history of JHX-series Pseudomonas

表5 JHX 系列菌種數量結構分析Table 5 Quantitative structure analysis of JHX strains

續表5 JHX 系列菌種數量結構分析Continue table 5 Quantitative structure analysis of JHX strains