肺炎克雷伯菌夾膜多糖激活AP-1誘導人支氣管上皮細胞表達β-防御素-3①

肖 非 胡 智 陽 君 曹二龍 伍 仙

(邵陽學院醫學檢驗學院病原生物學教研室，邵陽 422000)

肺炎克雷伯菌是社區獲得性和醫院感染最常見的革蘭陰性細菌，也是慢性阻塞性肺疾病最常見的感染性細菌。肺炎克雷伯菌的主要毒力因子包括細菌表面成分莢膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)[1,2]。肺炎克雷伯菌CPS能經TLR4識別并誘導細胞因子分泌[1]。氣道和肺部的上皮細胞是肺炎克雷伯菌面臨的第一道防線。呼吸道上皮細胞不僅是一種被動的物理屏障，而且是呼吸道固有免疫反應的重要活性效應細胞。因此了解肺炎克雷伯菌CPS與人呼吸道上皮細胞之間的復雜分子相互作用，有利于明確宿主的抗感染免疫機制?？咕氖窍忍烀庖呦到y的重要效應分子。它們是消除或抑制各種細菌、病毒、真菌和寄生蟲的第一道防線[3]。除了其抗菌活性外，它們還具有多種免疫調節功能，在先天免疫系統和適應性免疫系統的相互作用中發揮網絡調控作用[4,5]。在各類抗菌肽中，人β-防御素-3(hBD-3)在上皮免疫防御中起著特別重要的作用[6]。它對廣譜的病原體有很強的抗菌作用。目前尚不清楚hBD-3在氣道上皮細胞中的表達調控。尤其是hBD-3對肺炎克雷伯菌夾膜多糖的重要性尚不清楚。因此本研究旨在探討肺炎克雷伯菌夾膜多糖對hBD-3表達的影響，并研究其調控機制。

1 材料與方法

1.1材料 人支氣管上皮細胞株 BEAS-2B 購自 ATCC。小鼠抗人hBD-3多克隆抗體購自Abcam。小鼠抗人p38、ERK1/2、JNK1/2及c-Jun單克隆抗體購自Cell Signaling公司。SB203580、PD98059和SP600125以及PDTC 購自Sigma-Adrich。DMEM培養基Invitrogen公司，細胞蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo 公司。

1.2方法

1.2.1肺炎克雷伯菌的培養與夾膜多糖提取 肺炎克雷伯菌用含有100 μg/ml氨芐青霉素或50 μg/ml卡那霉素的LB培養基中培養。按照參考文獻[1]提供的方法提取CPS。即100℃加熱培養肺炎克雷伯菌以釋放其莢膜成分。隨后加入丙酮沉淀CPS。經RNase B(30 μg/ml)和DnaseⅠ(70 μg/ml)及鏈霉蛋白酶溶液(含10 mmol/L Tris HCl，pH7.4，1 mmol/L CaCl2)消化后用50 kD的透析膜對樣品進行透析、凍干。CPS粗提物隨后在TSK HW-65F柱上進一步純化并采用苯酚-濃硫酸法測定CPS的濃度。刺激細胞前采用2-酮基-3-脫氧辛酸(KOD)-硫代巴比妥酸法測定CPS中LPS的含量以排除LPS污染。

1.2.2細胞培養與處理 BEAS-2B細胞用有10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素的DMEM培養基于37℃，5% CO2培養。當細胞生長至80%～90%密度時，加入0.1～10.0 μg/ml CPS孵育24 h。

1.2.3實時定量PCR檢測 mRNA表達 通過逆轉錄測定上皮細胞中hBD-3 mRNA的水平，然后進行實時定量PCR。 使用TRIzol試劑提取總RNA。在 50 μl 反應體系中使用1 μg總RNA和隨機六聚體進行逆轉錄反應。 使用Primer Express軟件設計用于人hBD-3基因的引物和探針。 人hBD-3：正向引物，5′-GCCTCTTCCAGGTGTTTTTG-3′;反向引物：5′-GAGACCACAGGTGCCAATTT-3′。在ABI Prism 7700序列檢測系統上進行PCR。 25 μl PCR反應含有30 ng cDNA，100 nmol/L熒光探針和200 nmol/L引物。采用比較閾值循環(CT)方法，通過計算其與管家基因GAPDH的比值來確定相對基因表達水平。

1.2.4ELISA檢測hBD-3蛋白表達 細胞處理結束后，采用Millipore公司提供的Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit試劑盒將上清液濃縮10倍，隨后采用Phoenix公司提供的hBD-3試劑盒測定hBD-3的濃度，其原理基于雙抗體夾心法，方法按照試劑盒提供的步驟進行。

1.2.5Western blot檢測蛋白表達 經處理后的細胞樣品用含有Triton X-100的緩沖液溶解，隨后用SDS-PAGE分離，并轉印至Hybond ECL膜(Amersham Biosciences)。經過封閉后，先后用特異性抗體和相應的HRP標記的二抗進行檢測，最后化學發光、顯影。

1.2.6RNA干擾 使用非特異性siRNA(siRNA control，NWG Biotech)和特異性TLR4靶向siRNA(Ambion)進行RNA干擾實驗。按照參考文獻[7]提供的方法，采用Amaxa公司提供的Nucleofector試劑盒，將2 μg(約25 nmol/L)siRNA轉染至106個細胞內。

1.2.7染色質共沉淀實驗 按照參考文獻[8]提供的方法進行染色質共沉淀。即，細胞裂解并經超聲處理后，加入蛋白A/G瓊脂糖收集免疫復合物，用RIPA緩沖液和高鹽緩沖液徹底清洗后，隨后用洗脫緩沖液提取免疫復合物并用RNA酶消化。加入蛋白酶K在37℃消化6 h后，再置于65℃消化6 h。采用Qiagen公司提供的PCR純化試劑盒提取DNA，最后用Taq DNA聚合酶(Sigma)對hBD-3啟動子DNA進行了擴增，所用引物序列為5′-TCCCAGACACCCTT-3′(正向)和5′-TTCCAGCCAGCCATT-3′(反向)。

2 結果

2.1肺炎克雷伯菌CPS誘導BEAS-2B細胞表達hBD-3 mRNA和蛋白 BEAS-2B細胞給予0.1 μg/ml、1.0 μg/ml和10 μg/ml CPS孵育24 h后，實時定量PCR結果顯示，與陰性對照組相比，hBD-3 mRNA表達水平隨之增高，呈一定的濃度依賴性(圖1A)。此外，培養上清中hBD-3蛋白水平也具有類似的趨勢(圖1B)。

圖1 不同濃度CPS對hBD-3 mRNA和蛋白表達的影響Fig.1 Effects of different concentrations of CPS on expr-ession of hBD-3Note:*.P<0.05 vs 0 μg/ml group(Control group).

這表明肺炎克雷伯菌能誘導BEAS-2B細胞表達hBD-3。

2.2TLR4介導肺炎克雷伯菌CPS誘導BEAS-2B細胞hBD-3表達 為了探討CPS誘導hBD-3表達是否經TLR4介導，首先采用siRNA干擾BEAS-2B細胞上TLR4表達(圖2A)，隨后ELISA測定培養上清中hBD-3的表達量，結果顯示，沉默TLR4后，CPS誘導hBD-3表達顯著減少(圖2B)。

圖2 沉默TLR4對CPS誘導hBD-3表達的影響Fig.2 Effect of silencing TLR4 on CPS-induced hBD-3 expressionNote:A.RNA interference effect;B.Interfering with the effect of TLR4 on hBD-3 expression.Compared with control group(0 μg/ml),*.P<0.05；compared with the control siRNA group，#.P<0.05.

2.3肺炎克雷伯菌CPS經絲裂原蛋白活化激酶誘導BEAS-2B細胞表達hBD-3 TLR4與相關配體結合后，可激活下游絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)通路如p38、JNK和ERK[9]。Western blot結果顯示，10 μg/ml CPS處理30 min后均可激活p38、JNK和ERK，并持續至120 min(圖3A)。而采用25 μmol/L p38和ERK抑制劑SB203580及PD98059處理細胞后，hBD-3無明顯影響，而采用25 μmol/L JNK抑制劑SP600125處理后，hBD-3分泌明顯降低(圖3B)。

圖3 MAPKs介導CPS誘導hBD-3分泌Fig.3 MAPKs mediate CPS-induced secretion of hBD-3Note:A.CPS induced MAPKs phosphorylation;B.MAPKs inhibitors on CPS-induced hBD-3 expression.Compared with control group(0 μg/ml),*.P<0.05.

2.4AP-1參與調控hBD-3表達 研究表明，肺炎克雷伯菌可激活NF-κB。但采用NF-κB抑制劑PDTC預處理細胞后，對hBD-3表達無明顯影響(圖4A)，相比之下，CPS可誘導AP-1亞基c-Jun磷酸化(圖4B)。染色質共沉淀結果證實，CPS處理后可顯著增強AP-1與hBD-3啟動子的結合(圖4C)。

圖4 肺炎克雷伯菌CPS經AP-1誘導hBD-3表達Fig.4 K.pneumoniae CPS induces hBD-3 expression via AP-1

3 討論

病原微生物感染后，可誘導肺上皮細胞hBD-3的分泌，后者對多種病原體具有殺菌作用。細菌性肺炎患者中，血清中hBD-3水平明顯增高[10]。由于hBD-3具有廣泛的抗菌和免疫調節功能，它在宿主保護肺抵抗細菌病原體方面起著重要作用。在本研究中，我們發現肺炎克雷伯菌毒力因子夾膜多糖可誘導肺上皮細胞中的hBD-3分泌。在濃度1～10 mg/ml 的情況下，hBD-3被證明具有很強劑量依賴性。雖然細胞上清液中的hBD-3濃度僅在pg/ml范圍內檢測到，但目前還不清楚體內人呼吸道肺炎克雷伯菌感染所引起的分泌型hBD-3的濃度，而本研究發現肺炎克雷伯菌CPS刺激的細胞中hBD-3分泌量比基礎水平增加了近20倍。這表明肺炎克雷伯菌CPS可有效上調hBD-3的表達，但hBD-3在體內的抗菌活性還有待進一步探討。

病原微生物感染后，首先被宿主細胞膜上的Toll樣受體識別[11,12]。參與識別細菌的主要模式識別受體是TLR2和TLR4。TLR2主要識別細菌的各類脂蛋白，而TLR4主要識別多糖[13]。有研究表明，肺炎克雷伯菌CPS可通過TLR4誘導人單核細胞表達促炎性細胞因子[1]。本研究通過RNA干擾TLR4后發現，CPS對hBD-3的誘導能力明顯降低。這表明hBD-3受TLR4的介導。TLR4激活后，可活化絲裂原活化蛋白激酶如p38、ERK1/2和JNK，但本研究發現盡管CPS可誘導p38、ERK1/2和JNK磷酸化，但采用p38和ERK1/2抑制劑處理后，對hBD-3的誘導水平并無顯著影響，而抑制JNK后，hBD-3水平顯著降低，這表明JNK直接參與hBD-3的表達。本研究的另一個發現是NF-κB并不參與調控CPS誘導hBD-3表達，相比之下，hBD-3主要受AP-1的調控，本研究通過檢測c-Jun磷酸化以及染色質共沉淀也證實了這一點。

綜上所述，本研究證實肺炎克雷伯菌致病物質CPS可誘導氣道上皮細胞表達hBD-3，后者可能是機體拮抗并清除病原微生物的機制。該機制有賴于TLR4/JNK/AP-1通路，最終導致hBD-3的表達而參與免疫應答。