IL-34誘導肺成纖維細胞IL-6、IL-8表達機制研究

吳夏楠 羅 艷 鄒 鱗 賴曉霏

(重慶醫科大學附屬第一醫院醫學檢驗科，重慶 400016)

IL-34是集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R)的新配體，在心臟、肝臟、大腦、腎臟及胸腺多個組織均有表達[1]。盡管IL-34與集落刺激因子1(colony stimulating factor 1，CSF-1)具有相同的受體及相似的功能，但在原始序列中幾乎沒有同源性[2]。有報道認為，IL-34與CSF-1R結合的親和力高于CSF-1，可誘導CSF-1R及其下游分子發生更強的酪氨酸磷酸化[3]；而與其他兩個受體PTP-ζ及syndecan-1親和力較低[4,5]。

越來越多臨床研究表明，IL-34與多種炎癥性疾病相關。例如，過敏性紫癜患者急性期血清中IL-34顯著上調[6]；類風濕關節炎患者滑膜液、成纖維滑膜細胞和血清中IL-34表達升高，進一步的研究確認，IL-34可作為預測TNF-α拮抗劑治療效應的潛在標志物[7]。IL-34在炎癥黏膜上皮層和結締組織浸潤的免疫細胞中表達顯著增加[8]。IL-34也可作為慢性乙型肝炎病毒感染患者肝纖維化的一種炎癥生物標志物[9]。

IL-34作為一種新的促炎性細胞因子，影響著免疫和炎癥反應的多個方面。IL-34的產生還與神經元保護、感染、自身免疫疾病和血管生成有關[10]。IL-34在肺癌和肺部感染中表達上調，提示IL-34在肺免疫中發揮重要作用。然而，IL-34是否通過分泌炎癥介質直接作用于肺組織細胞來啟動、放大和維持炎癥反應機制尚不清楚。本研究的主要目的是確定IL-34對人肺成纖維細胞的影響，并揭示其調節肺免疫應答的潛在機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 原代人肺成纖維細胞(human lung fibroblasts，HLF)購自美國ScienCell Research，細胞專用培養基購自美國Gibco Invitrogen。原代人成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS) 購自Cell Applications (San Diego，CA)，用含10%滑膜細胞生長因子(Cell Applications)的培養基于37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。

1.1.2試劑 重組IL-34蛋白購自美國R&D公司，重組IL-4、IL-17A、TNF-α購自美國Peprotech公司；小分子抑制劑 JAK(AG490)、IкB-α(BAY11-7082)、PI3K(LY294002)、ERK(U0126)、MAPK(SB203580)、JNK(SP600125)購自美國Calbiochem，JAK、NF-κB、IкB-α、PI3K、ERK、MAPK、JNK總蛋白抗體及磷酸化蛋白抗體均購自美國Cell Signaling Technology(CST)；抗CSF-1R抗體(AFS98)購自美國GeneTex。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測細胞IL-34、IL-6及IL-8 mRNA表達水平 細胞總RNA提取使用RNeasy columns試劑盒(Qiagen)進行，所有RNA樣品在進一步處理前均采用DNase I (Invitrogen)處理。RNA樣品逆轉錄為cDNA應用TaqMan反轉錄試劑盒(Biosystems)進行，GAPDH作為內參對照，檢測數據采用標準曲線和比較Ct值法(2-ΔΔCT法)進行相對定量分析。

1.2.2ELISA、蛋白印跡法 (Western blot) 檢測蛋白表達水平 細胞培養上清液IL-6及IL-8表達采用美國Millipore公司ELISA試劑盒檢測，所有操作按試劑說明書進行。細胞接種于10 cm培養皿中(5×106個/培養皿，用IL-34(50 ng/ml)處理細胞0、10、30、60 min 后，提取細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度；等量蛋白質上樣、電泳、轉膜及封閉，一抗(1∶1 000)4℃ 孵育過夜；適當稀釋的二抗室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，凝膠成像儀觀察結果。以β-actin為內參，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值為目的蛋白的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Sequence of RT-qPCR primer

2 結果

2.1人肺成纖維細胞中IL-34受體CSF-1R的表達 為研究IL-34是否能直接作用于肺組織細胞，我們檢測了原代人肺成纖維細胞中CSF-1R的表達，成纖維樣滑膜細胞作為陽性對照。結果顯示，CSF-1R在這兩種細胞中均有表達。當我們用抗CSF-1R抗體(10 μg/ml)處理肺成纖維細胞24 h時(圖1B)，與未處理組細胞(圖1A)相比，CSF-1R表達顯著降低(P<0.05)。因此，進一步證實肺成纖維細胞表達IL-34受體CSF-1R。

圖1 CSF-1R在人成纖維樣滑膜細胞(FLS)和肺成纖維細胞(HLF)中mRNA的表達情況Fig.1 Expression of CSF-1R mRNA levels in human fibroblast-like synoviocytes(FLS) and lung fibroblasts (HLF)

2.2IL-34刺激人肺成纖維細胞產生IL-6、IL-8 mRNA表達 為了研究IL-34對肺成纖維細胞的影響，重組IL-34在不同時間點以相應劑量作用于細胞。結果顯示，IL-8 mRNA水平在6 h時增加了近3倍，IL-6 mRNA在24 h時增加了46倍 (圖2A、B)。此外，IL-6和IL-8蛋白表達水平呈劑量和時間依賴性增加(圖2C、D)；重組IL-34刺激之前，用抗CSF-1R抗由于肺內多種免疫細胞都可以分泌細胞因子和趨化因子，本研究評估了IL-34誘導IL-6和IL-8 表達是否為其他細胞因子共同刺激的結果。采用重組TNF-α (50 ng/ml)、IL-4 (100 ng/ml)和IL-17A (100 ng/ml) 蛋白單獨作用或與IL-34(50 ng/ml)共同作用于肺成纖維細胞，結果顯示，IL-34分別與這三種炎性細胞因子聯合作用時，IL-8和IL-6蛋白水平表達顯著升高(圖3A～F)。

圖2 IL-34刺激肺成纖維細胞誘導IL-8和IL-6 mRNA和蛋白的表達Fig.2 mRNA and protein expression of IL-8 and IL-6 in human lung fibroblasts induced by IL-34Note: Compared with Control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖3 IL-34單獨或聯合TNF-α、IL-4、IL-17A 作用肺成纖維細胞后IL-8 和IL-6 的蛋白表達情況Fig.3 Protein expression of IL-8 and IL-6 in human lung fibroblasts treated with IL-34,TNF-α,IL-4,IL-17A either alone,or in combinationNote: Compared between groups，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

體(AFS，10 μg/ml)處理細胞24 h，IL-6和IL-8 mRNA表達顯著減弱(P<0.001，見圖2E、F)。

2.3信號分子抑制劑可逆轉IL-34誘導人肺成纖維細胞IL-6和IL-8表達升高 MAPK、NF-κB、PI3K-Akt和JAK是肺成纖維細胞內炎性因子表達的重要信號轉導通路。為了闡明這些激酶的功能作用，本研究應用特異性信號通路抑制劑AG490(5 μmol/L)，BAY11-7082 (1.2 μmol/L)，LY294002 (10 μmol/L)，SB203580 (20 μmol/L)， SP600125(5 μmol/L)，U0126 (10 μmol/L) 預處理肺成纖維細胞1 h，緊接著IL-34(50 ng/ml)刺激24 h后檢測上清液細胞因子表達變化。結果顯示，p38MAPK、ERK、Akt、NF-κB抑制劑可以逆轉IL-34誘導IL-8表達升高(圖4A)，IL-6表達主要被JAK、NF-κB、Akt、p38MAPK抑制劑阻斷(圖4 B)，其中p38MAPK抑制劑對二者阻斷效應最明顯。提示p38MAPK通路可能在IL-34誘導IL-6和IL-8的產生中起關鍵作用。

圖4 信號通路抑制劑對IL-34誘導IL-8和IL-6蛋白表達的影響Fig.4 Effects of signaling pathway inhibitors on IL-34-induced IL-8 and IL-6 expressionNote: Compared with IL-34 groups，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4IL-34誘導人肺成纖維細胞信號通路磷酸化 為了進一步探索IL-34在人肺成纖維細胞中活化的具體分子途徑，外源性重組IL-34 (50 ng/ml)刺激細胞，并檢測0、10、30、60 min蛋白的磷酸化。結果顯示，IL-34作用細胞后10 min內誘導p38MAPK和JAK通路強磷酸化(P<0.01)；Akt、NF-κB信號也在30～60 min誘導較強磷酸化(P<0.001，圖5)。結果顯示IL-34可能通過MAPK、PI3K-Akt、JAK、NF-κB信號通路誘導肺成纖維細胞產生IL-6和IL-8。

圖5 IL-34對肺成纖維細胞 p38 MAPK，ERK，JNK，JAK，Akt，NF-κB細胞信號分子的影響Fig.5 Effects of IL-34 on activation of p38 MAPK,ERK,JNK,JAK,Akt and NF-κB signaling pathwaysNote: Compared with Time(0) groups，**.P<0.01；***.P<0.001.

3 討論

IL-34參與許多疾病的免疫調節。近年來在自身免疫性疾病、炎癥性腸病、感染及神經系統功能障礙中研究較多[9]，在癌癥中的作用也正在顯現：在急性白血病中，IL-34誘導白血病細胞向類似單核細胞的細胞類型分化，為白血病的治療提供新的思路[11]；IL-34和CSF-1均由增強巨噬細胞浸潤的乳腺上皮細胞產生，可用于評估復發和轉移的風險[12]。在肝細胞癌中，IL-34表達上調誘導腫瘤相關巨噬細胞浸潤，在腫瘤生長及轉移中發揮著重要作用[13]。

在肺癌腦轉移灶中發現了CSF-1、CSF-1R和IL-34的差異表達，提示阻斷IL-34信號通路可能是一種新的治療策略[14,15]。此外，阻斷CSF-1R靶向TAM是治療小鼠肺癌的一種方法[16]。在甲型流感感染中，血清和外周血單核細胞中IL-34水平較高，提示抑制IL-34介導的炎癥通路可能是一種預防流感的方法[17]。這些研究共同顯示，IL-34參與肺癌和肺部感染免疫調節。然而，IL-34作為一種免疫調節分子在肺免疫反應中的作用機制尚不清楚。

先前的研究已經表明，在成纖維樣滑膜細胞中炎性因子TNF-α和IL-1β誘導IL-34的表達[18,19]。TNF-α與TLR配體共同刺激固有層單核細胞，IL-34表達上調[20]。此外，TNF-α增強由脂肪細胞分泌的IL-34表達[21]。然而，當我們采用重組TNF-α、IL-1β或脂多糖作用人肺成纖維細胞和支氣管上皮細胞24 h，沒有檢測到細胞培養上清液中IL-34的表達。當然，還需要更多研究來證實IL-34在肺中的來源。IL-34在中樞神經系統和皮膚中具有穩定的選擇性表達，在自身免疫性疾病、感染性疾病、炎癥和癌癥等病理狀態下被誘導產生，因此，IL-34在病理條件下可通過循環在肺部表達[22]。

之前的研究強調人肺成纖維細胞和支氣管上皮細胞在肺部感染和免疫中發揮重要作用[23,24]。IL-6是一種典型的促炎細胞因子，在炎癥中起關鍵作用；IL-8是一種中性粒細胞趨化劑，參與白細胞浸潤[25]。在本研究中，我們檢測了CSF-1R及炎性因子IL-6、IL-8在人肺成纖維細胞中的表達情況。結果顯示，IL-34作用細胞后IL-6和IL-8轉錄和蛋白表達水平顯著升高；阻斷CSF-1R引起IL-6和IL-8表達減弱，提示IL-34/CSF-1R通路可能參與IL-34對肺部炎癥反應的免疫調控。

TNF-α、IL-4和IL-17A在氣道炎癥中扮演著重要角色，如哮喘、慢性阻塞性肺病中Th1細胞因子TNF-α表達上調[26,27]；Th2細胞因子IL-4促進B細胞IgE的產生，在哮喘發生中起關鍵作用[28]。除此之外，IL-4在COPD小鼠模型中也有上調[29]。

Th17細胞因子IL-17A在哮喘患者中升高，誘導中性粒細胞募集，與嚴重氣道炎癥相關[30]。本研究發現，IL-34聯合TNF-α、IL-4和IL-17A共同刺激可顯著增強肺成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達，這可能促進嚴重肺部炎癥和疾病的發生發展。在原代人支氣管上皮細胞中，TNF-α活化Akt、p38 MAPK、IkB-α通路磷酸化誘導IL-6、ICAM1表達[31]；TNF-α和IL-4促進IL-8的釋放[32]；IL-17激活ERK信號通路誘導IL-6、IL-8表達[33]。這些數據表明，IL-34與IL-4、TNF-α、IL-17A誘導IL-6、IL-8表達可能激活共同的信號通路。

本研究結果提示，IL-34通過激活MAPK、PI3K-Akt、JAK、NF-κB信號通路誘導IL-6、IL-8表達，而且這些通路與受體磷酸化相關。另外，盡管IL-34與其他受體(PTP-ζ和syndecan-1)親和力較低，但是PTP-ζ可以增強IL-34的生物效應[4]，syndecan-1是IL-34 /M-CSFR一個關鍵的調節點[5]。因此，在未來的研究中，我們將深入研究人肺成纖維細胞PTP-ζ和syndecan-1是否參與IL-34介導IL-6、IL-8表達。總之， IL-34通過激活人肺成纖維細胞MAPK、PI3K-Akt、JAK、NF-κB信號通路誘導IL-6、IL-8表達，闡明了IL-34在肺成纖維細胞中的炎癥作用，提示IL-34/CSF-1R通路可能是未來肺部疾病治療策略的潛在靶點。