姜黃素通過抑制TGF-β/smad2信號通路抑制人肝星狀細胞纖維化作用研究①

王國泰 李京濤 魏海梁 閆曙光 李 寧

(陜西中醫藥大學附屬醫院肝膽外科，咸陽 712000)

肝纖維化是肝細胞收到外源性炎癥刺激后，受損肝臟周圍大量聚集了膠原蛋白和纖維黏連蛋白等細胞外基質，同時導致正常膠原蛋白降解功能失常，進而造成纖維結締組織和膠原等在受損肝臟周圍異常沉積的病理過程[1,2]。肝臟受損時肝星狀細胞在肝竇狀隙中被激活，眾多的證據表明HSC激活是肝纖維化過程的關鍵，是纖維狀和非纖維狀基質蛋白的主要來源。肝星形細胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活能夠增加細胞外基質的沉積、促進收縮平滑肌 α-肌動蛋白的表達增加、促炎細胞因子的釋放和基質降解酶及其抑制物的釋放。HSC的激活是導致肝纖維化的主要因素，激活的HSC分泌大量細胞外間質，影響肝臟的功能，引起細胞因子及細胞群的一系列變化。臨床上大量數據表明早期的肝纖維化是可以通過治療逆轉，但是若病情進一步發展則會發展成肝硬化甚至是肝癌[3]。

目前臨床上沒有特別有效的藥物來控制和治療肝纖維化，因此針對肝纖維化的藥物研究一直是臨床的研究熱點。TGF-β1/Smad通路是肝纖維化發生的重要信號通路，研究表明在體內建立以CCl4誘導的小鼠肝纖維化模型[3]，探討Smad2和Smad3在肝纖維化中的作用，結果發現在肝臟纖維化組織中發現了Smad2和Smad3的磷酸化[2]。因此針對抑制TGF-β1/Smad信號通路的藥物就成為肝纖維化的研究熱點。

姜黃素是從傳統中醫藥姜黃中提取的一種單體，其物理特性表現為橙黃色粉末結晶，味苦，不溶于水，易溶于乙醇和冰醋酸以及堿溶液。現代研究發現姜黃素可以很好地抑制炎癥的發生、同時可以抗氧化、抗凝降脂、消除自由基和抑制腫瘤增殖等作用[4]。結合姜黃素可以抗炎的作用，設想其是否對肝纖維化有一定的作用。因此，本研究采用人肝星狀細胞LX-2為研究目標，來研究姜黃素是否可以抑制肝纖維的進程及其可能的作用機制，為臨床上肝纖維化的治療提供可行的治療策略。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 人肝星狀細胞LX-2購自中科院上海細胞庫，姜黃素單體購自陜西省食品藥品檢驗所，蛋白定量試劑盒、SDS凝膠試劑盒、細胞裂解液、結晶紫、高錳酸鉀、草酸、冰醋酸和磷鎢酸均購自西安科昊生物有限公司，蛋白酶抑制劑購自羅氏試劑生物有限公司，4%多聚甲醛、DMEM培養液、胎牛血清、胰蛋白酶消化液和青鏈霉素購自美國HyClone，β-actin、Ku70和CDK12抗體購自英國 Abcam，兔二抗購自英國 Abcam，Trans-well小室購自康寧。

1.1.2儀器 CFX96 real-time PCR儀、S1000TM Thermal Cycler PCR儀(Bio-Rad，美國)；Western blot儀器(Bio-Rad，美國)。

1.2方法

1.2.1CCK-8增殖實驗 調整LX-2細胞密度為4×105個/孔直接鋪板，細胞密度達至80%左右，10 ng/ml TGF-β1刺激24 h，隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h。結束后每孔加入20 μl CCK-8試劑，避光3 h，搖床振蕩15 min。設置酶標儀450 nm檢測細胞CCK-8混合液OD值進行活力分析。

1.2.2qRT-PCR 調整LX-2細胞密度為4×105個/孔直接鋪板，細胞密度達至80%左右，10 ng/ml TGF-β1刺激24 h，隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h，嚴格按照試劑盒步驟提取、定量、反轉錄和PCR反應。引物序列如下，CollagenⅠ:Forward-ATTTTTCTGDCGACACCCGAT，Reverse-TCCCAGGTGTAGACCAA；CollagenⅢ For-ward-ATTTTTGTACACACCCGAT，Reverse-TGACCG-GTGTAGACCAA;α-SMA Forward-ATTTTTGCCCGAT-ACCCGAT，Reverse-TGACCGTCATAGACCAA和β-actin：Forward-ATTTTTGTACACACAATGC，Reverse-TGACCGGTGTCCCTGACGAT。

1.2.3Western blot 調整LX-2細胞密度為4×105個/孔直接鋪板，細胞密度達至80%左右，10 ng/ml TGF-β1刺激24 h，隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h。隨后消化細胞鋪至培養皿，細胞密度80%時收集細胞，裂解液(含有蛋白酶抑制劑)冰上裂解30 min后高速離心機4℃ 13 000 r/min 離心30 min后吸取上層蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。電泳結束后進行轉膜，隨后用脫脂牛奶進行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋一抗(Ku70、CDK12和β-actin)，4℃過夜。第2天冷的PBS清洗條帶3次，二抗孵育1 h，發光儀發光拍照。

1.2.4CCl4誘導小鼠肝纖維化模型 C57小鼠分組，分為空白對照組(Normal)、PBS組和姜黃素(Curcumin)組，每組6只。CCl4和橄欖油(2∶3)按比例混勻，每周兩次皮下注射，注射劑量3 ml/kg，連續注射6周。PBS組小鼠PBS給藥處理，姜黃素組給藥100 mg/kg，每周3次給藥，連續給藥6周。6周后CO2處死所有小鼠，收集每只小鼠血液，肝臟固定在4%多聚甲醛，在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃。

1.2.5小鼠肝功能相關指標檢測 肝纖維化模型造模成功6周后，采集小鼠血液，采用離心分離處理,臺式離心機轉速為13 000 r/min,處理時間為20 min,離心分離后取上清液進行檢測。全自動生化分析儀、酶標儀及配套試劑盒完成檢測，肝功能指標包括ALT、AST、ALB和TP。

1.2.6ELISA 測IL-10和IFN-γ水平 肝纖維化模型造模成功6周后，采集小鼠血液，采用離心分離處理,臺式離心機轉速為13 000 r/min,處理時間為20 min,離心分離后取上清液進行檢測。嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟，檢測血液上清中IL-10和IFN-γ的含量。

1.2.7羥脯氨酸的測定 稱取小鼠肝組織100 mg，置于安瓿瓶中，加入2.5 ml純水和2.5 ml濃鹽酸封瓶，置于105℃烘箱中水解18 h，濾紙過濾即得肝組織水解液。取10 μl水解液，加入10 μl內標溶液(10 mg/L)，用72%乙腈水溶液定容至10 ml，取稀釋液1 ml，以13 000 r/min離心10 min，取上清，用試劑盒進行測定。

1.2.8HE染色 按1.2.4方法進行分組和給藥。給藥6周后，CO2處死小鼠，分離出肝臟盡量去除結締組織，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定24 h，EDTA脫鈣，常規石蠟包埋，并將包埋標本切成4 μm薄片，依次進行石蠟切片脫蠟至水、蘇木素(Hematoxylin)染色、伊紅(Eosin)染色、脫水封片操作，顯微鏡鏡檢，圖像采集，Image J軟件進行分析。

1.2.9馬松染色 中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規脫蠟至水。入天青石藍液染10 min。蒸餾水洗3次。馬松和苦味酸染30 min。無水酒精直接分化和脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。染色的結果膠原呈藍色。

2 結果

2.1姜黃素抑制了LX-2的增殖作用 正常體外培養LX-2細胞，不進行任何處理，分別不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μmol/L)48 h，結果發現5～35 μmol/L姜黃素對LX-2細胞增殖沒有影響(圖1A)，而45和50 μmol/L則現在抑制LX-2細胞增殖，導致細胞凋亡，因此后續姜黃素給藥濃度控制在50 μmol/L以內。

圖1 不同濃度姜黃素對LX-2細胞的作用Fig.1 Effect of curcumin at different concentrations on LX-2 cellNote:A.Toxicity of curcumin at different concentrations on LX-2 cells；B.Inhibition of curcumin at different concentrations on TGF-β activated LX-2 cells.***.P<0.001.

正常生理條件下人肝星狀細胞處于靜態，肝臟受到外源性損傷發生炎癥反應時會激活人肝星狀細胞的活化與增殖，使其在受損肝臟周圍快速增殖聚集。體外我們用10 ng/ml TGF-β1刺激人肝星狀細胞LX-2 24 h，來模擬這種損傷。隨后不同濃度姜黃素給藥處理(5、10、15、20、25 μmol/L)48 h，CCK-8檢測各組LX-2細胞的增殖情況。結果發現隨著姜黃素濃度的增高，可以顯著抑制活化狀態下的LX-2細胞的增殖(P<0.05)，并且發現且姜黃素20 μmol/L抑制作用最強(圖1B)(P<0.05)，因此后續實驗均以20 μmol/L姜黃素為研究基礎。此結果說明姜黃素對活化狀態下的人肝星狀細胞LX-2具有抑制作用，為后續的研究奠定一定基礎。

2.2姜黃素抑制LX-2細胞纖維相關蛋白和免疫炎性因子的表達 姜黃素對活化狀態下的人肝星狀細胞LX-2的增殖具有抑制作用，通過qRT-PCR和Western blot我們檢測了CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA表達變化，結果發現姜黃素可以顯著抑制CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA的表達(P<0.05)，降低其在活化狀態下LX-2細胞的含量；通過ELISA檢測了IL-10和IFN-γ的表達變化，結果同樣發現姜黃素可以有效抑制免疫炎性因子IL-10和IFN-γ的表達(P<0.05)，說明姜黃素對纖維相干蛋白和免疫炎性反應具有抑制作用。見圖2。

圖2 姜黃素對纖維相關蛋白和免疫炎性因子表達的影響Fig.2 Effect of curcumin on expression of fiber-related proteins and immunoinflammatory factorsNote:A.qRT-PCR was used to detect the effect of curcumin on fiber-related protein expression；B.ELISA was used to detect curcumin on immuno-inflammatory factors IL-10 and IFN-γ expression effect；C.Western blot was used to detect the effect of curcumin on fiber-related protein expression.**.P<0.01,***.P<0.001.

2.3姜黃素抑制LX-2細胞內p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路 目前已有研究結果表明，TGF-β1可以激活smad2的磷酸化，促使其進入細胞核促進p-65的表達從而發揮調節促纖維化的作用，Western blot結果顯示姜黃素顯著抑制smad2的磷酸化和p-65的表達(P<0.05)，說明在細胞水平姜黃素素抑制了p-smad2介導的p-65/NF-κB經典纖維化信號通路。見圖3。

圖3 姜黃素對p-smad2和p-65表達的影響Fig.3 Effect of curcumin on expression of p-smad2 and p-65Note:**.P<0.01;***.P<0.001.

2.4姜黃素改善CCl4誘導的肝纖維小鼠肝組織和肝功能損傷 經CCl4誘導成功構建C57肝纖維化小鼠模型，姜黃素腹腔給藥，6周后處死小鼠，收集各組小鼠血清和肝組織進行肝功和HE染色。肝纖維化過程中，谷草轉氨酶(AST)及谷丙轉氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)對肝功能具有一定的指向性，血液分析結果顯示，與PBS組相比，姜黃素顯著降低了CCl4誘導小鼠血液中AST、ALT、Cr和BUN的表達(P<0.05)；同時HE染色結果顯示姜黃素有效改善了CCl4誘導小鼠肝組織損傷，組織中中性粒細胞和巨噬細胞數量顯著減少(P<0.05)，與PBS組相比，組織結構排列有序，細胞碎片明顯減少。這說明在體內姜黃素可以改善纖維化小鼠肝組織損傷和肝功能損傷，有利于小鼠維持更長的生存期。見圖4。

2.5姜黃素抑制CCl4誘導的肝纖維小鼠肝組織內膠原的沉積 膠原的沉積是造成肝臟發生纖維化的主要原因，小鼠造模給藥結束后馬松染色檢測各組肝組織內纖維蛋白的表達，與PBS組相比較，發現姜黃素可以有效抑制纖維蛋白的表達(P<0.05)；Western blot檢測結果發現姜黃素顯著抑制肝組織內α-SMA的表達(P<0.05)。見圖5。

圖5 姜黃素對小鼠肝組織纖維化的抑制情況Fig.5 Inhibition of curcumin on liver fibrosis in miceNote:A.Masson staining to detect the expression of curcumin in liver tissue of mice；B.Effect of curcumin on the expression of hydroxyproline in liver tissue of mice.***.P<0.001.

2.6姜黃素抑制CCl4誘導的p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路 在細胞水平研究發現姜黃素可以抑制p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路，在體內這種抑制作用是否仍存在，我們通過Western blot檢測了各組小鼠肝組織內p-smad2和p-65的表達，結果表明在體內姜黃素同樣可以有效抑制p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路，從而抑制肝纖維化的發生發展。見圖6。

圖6 姜黃素在體內對p-smad2和p-65表達影響Fig.6 Effect of curcumin on expression of p-smad2 and p-65 in vivo3Note:**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

肝纖維化是臨床上較為常見的一種肝臟疾病，在發病早期具有一定的可逆轉性，若不及時治療隨著病情的發展會形成肝硬化甚至是肝癌[5]，很多患者發現時已經處于肝纖維化病情較為嚴重的階段[6]。肝纖維化形成的原因，目前尚不完全清楚，其是多基因多因素參與形成的結果[7,8]。目前較為公認的說法是膠原沉積和纖維黏連蛋白的過度表達以及免疫相關炎性因子釋放是造成肝纖維化的主要原因[9,10]。目前TGF-β/p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路是纖維化研究的熱點[10]。

傳統中藥在肝病的治療上有獨特的優勢[11,12]，毒副作用小，來源廣泛，可以作為治療肝病等多種疾病的寶庫。姜黃素是從傳統中醫藥姜黃中提取的一種單體，其物理特性表現為橙黃色粉末結晶，味苦，不溶于水，易溶于乙醇和冰醋酸以及堿溶液。現代研究發現姜黃素可以很好地抑制炎癥的發生，同時可以抗氧化、抗凝降脂、消除自由基和抑制腫瘤增殖等作用[9,13]。姜黃素對肝纖維化的作用目前報道較少，具體機制更是闡明不清楚。

本研究主要研究了傳統中藥姜黃的提取單體姜黃素對肝纖維化的作用及其作用機制。體外研究結果可知姜黃素可以有效抑制TGF-β1激活的人肝星狀細胞LX-2細胞的增殖，同時顯著抑制CollagenⅠ、CollagenⅢ和α-SMA以及免疫炎性因子IL-10和IFN-γ的表達，說明姜黃素在體外對肝纖維化相關的因子具有很好的抑制作用，為證明這種抑制作用是否通過TGF-β/p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路來實現，隨后檢測了LX-2細胞內p-smad2和p-65的表達，結果發現姜黃素可以有效抑制smad2的磷酸化和p-65的表達，其可能的機制是通過抑制smad2的磷酸化從而阻止其入核，進而影響p-65/NF-κB信號通路，影響下游纖維蛋白基因的編碼和翻譯。體外實驗中我們通過CCl4構建C57小鼠肝纖維化模型，腹腔給藥的方式注射姜黃素，結果發現姜黃素可以有效改善小鼠肝功能損傷，降低小鼠血液中谷草轉氨酶(AST)及谷丙轉氨酶(ALT)、肌酐(Cr)及尿素氮(BUN)的表達，同時減少組織中中性粒細胞和巨噬細胞等免疫細胞的數量，減輕炎癥反應。通過馬松染色和羥脯氨酸的測定，我們發現姜黃素可以顯著減少小鼠體內纖維蛋白的表達，通過Western blot檢測我們發現在體內姜黃素同樣可以有效抑制smad2的磷酸化和p-65的表達。

綜上所述，在體內和體外姜黃素是通過阻滯p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路抑制了肝纖維化的作用，這為中藥姜黃素的臨床應用和肝纖維化的藥物治療都提供了一定的實驗依據。但是姜黃素又是通過哪些上游因素來調控TGF-β/smad2信號通路，除了對p-smad2介導的p-65/NF-κB信號通路有抑制作用，對其他纖維化信號通路是否同樣有抑制作用，這將是我們下一步的研究重點。