建立聯合檢測人附睪蛋白4、糖類抗原15-3熒光層析方法①

王云龍 李 果 李玉林 王繼創 程 蕾 張怡青

(河南師范大學生命科學學院，新鄉 453002)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年升高，并呈年輕化趨勢[1]。早診斷、早發現，對乳腺癌患者及時進行有效的治療和預后具有重要意義。2007年美國臨床腫瘤學會將血清糖蛋白抗原CA15-3(breast cancer antigen,CA15-3)推薦為初級治療后乳腺癌患者的篩查、診斷、分期或常規監測的一種重要腫瘤標志物[2]，王燕敏等[3]的研究表明CA15-3的特異性為75%，敏感性為55.89%，其特異性及敏感性都不太理想。周巖等[4]、魏蓉[5]的研究結果顯示人附睪蛋白4 (human epididymis protein 4，HE4)在正常細胞中低表達，而在乳腺癌細胞系中呈高表達。乳腺癌患者和乳腺良性腫瘤患者血清HE4水平與血清CA15-3水平均呈正相關[6-8]，HE4和CA15-3聯合檢測有助于乳腺癌的輔助診斷[6,9-13]，其檢出率可高達92.5%[6]，明顯提高乳腺癌臨床診斷的效果，HE4與CA15-3聯合檢測能夠更好地指示乳腺癌的發展變化。聯合檢測成為近年來研究的熱點，但臨床上未見CA15-3與HE4聯合檢測熒光免疫層析的產品，本研究初步建立了聯合檢測HE4、CA15-3熒光免疫層析的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗材料 PVC板購自上海良信生物科技有限公司，吸水紙、玻璃纖維棉購自通城印刷廠，硝酸纖維素膜(CN-140)購自德國Sartorius，基質血清、臨床定值血清樣本由河南省生物工程技術研究中心提供。

1.1.2試劑 碳化二亞胺(EDC)購自生工生物工程(上海)有限公司，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)購自深圳海王英特龍生物有限公司，羧基修飾時間分辨熒光微球(固含量1%)、HE4配對單克隆抗體、CA15-3配對單克隆抗體、鼠抗兔單抗、兔多抗IgG，HE4線性質控品(3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500、1 000、1 500、2 000 pmol/L)、CA15-3線性質控品(0.97、1.95、3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500 U/ml)、HE4精密性質控品(50、150、300 pmol/L)、CA15-3精密性質控品(20、80、200 U/ml)、特異性質控品(CA12-5 300 U/ml、CA19-9 300 U/ml、CEA 50 ng/ml)均由河南省生物工程技術研究中心提供。

1.1.3實驗儀器設備 超微量紫外分光光度計(NanoDrop One型)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；臺式恒溫振蕩器(THZ-92B型)購自上海躍進醫療器械有限公司；熒光免疫層析讀數儀購自杭州峰航科技有限公司；紫外分析儀(JY03型)購自北京君意東方電泳設備有限公司；臺式高速離心機(H1850)購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；三維噴金點膜儀、微電腦自動斬條機購自上海金標生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1免疫微球、免疫微球墊包被板的制備 取800 μl 0.05 mol/L，pH=8.0硼酸鹽緩沖液(下同)，加入10 μl的熒光微球，1 mg/ml的EDC和NHS各40 μl，室溫振蕩活化30 min后；15 000 r/min離心30 min，棄上清，加入1 000 μl 硼酸鹽緩沖液中，重懸微球，加入20 μg標記抗體，室溫低速振蕩偶聯2 h 后；12 000 r/min離心30 min，棄上清，加入1 500 μl 復溶液，使已偶聯抗體的微球均勻重懸，加入20 μl 10%BSA，混勻，室溫低速振蕩封閉30 min，完成免疫微球的制備，密封避光4℃保存備用。按照以上方法分別標10 μg、40 μg、30 μg標記抗體制得兔多抗IgG、HE4單克隆標記抗體和CA15-3單克隆標記抗體的微球。在三維平面點膜噴金儀上，將制備好的兔多抗IgGHE4標記抗體和CA15-3標記抗體，免疫微球等體積混合后，均勻噴涂到已處理且烘干后的微球結合墊上，37℃，干燥10 h后，密封避光4℃保存備用。在三維平面點膜噴金儀上，將鼠抗兔單抗、HE4單克隆包被抗體、CA15-3單克隆包被抗體稀釋至2.0 mg/ml、3.0 mg/ml和2.0 mg/ml，包被于PVC板的NC膜中央位置上，作為質控線(C線)和檢測線(T1線、T2線)，37℃，干燥2 h后，密封避光4℃保存備用。

1.2.2試紙條的組裝 將吸水紙、免疫微球墊、包被板、樣品墊依次按圖1所示，組合到包被板上，用微電腦自動斬條機切成3.9 mm寬的試紙條,密封避光4℃保存備用。

圖1 試紙條組裝示意圖Fig.1 Schematic diagram of test strip assembly

1.2.3樣本的檢測 取70 μl待測樣本，滴加在樣品墊上，到達檢測時間后，立即用干式熒光免疫分析儀檢測，記錄試紙條的C、T線熒光值。將檢測的結果代入標準曲線方程，得到樣本濃度值。

1.2.4檢測方法的評價

1.2.4.1檢測時間的確定 取HE4精密性質控品、CA15-3精密性質控品按照70 μl的加樣量進行加樣，分別在加樣后 5、8、10、12、15、18、20 min檢測試紙條的 C、T 線熒光強度，記錄熒光值，計算 T/C值。

1.2.4.2標準曲線 取HE4線性質控品、CA15-3線性質控品，滴加在樣品墊上，15 min后，立即用干式熒光免疫分析儀檢測，各濃度重復檢驗5條，記錄熒光值。

1.2.4.4精密性 隨機抽取同一批試紙條和三個不同批次的試紙條，分別用HE4精密性質控品、CA15-3精密性控品，進行檢測，各濃度重復檢驗10條，分別計算批內變異系數和批間變異系數。

1.2.4.5特異性 取HE4 (1 000 pmol/L)和CA15-3 (1 000 U/ml) 質控品等體積混合，并將混合液用基質血清倍比稀釋，制得最終濃度HE4 250 pmol/L， CA15-3 250 U/ml；HE4 125 pmol/ml，CA15-3 125 U/ml；HE4 62.5 pmol/L，CA15-3 62.5 U/ml；三份待檢測樣本，重復檢測5次，分別計算其理論值，與真實值比較。取特異性質控品，與含HE4 500 pmol/L，CA15-3 500 U/ml的室內質控品等體積混合，重復檢測5次，分別計算其理論值，與真實值比較。

1.3方法學比較 用所建立的HE4、CA15-3聯合檢測試紙條與羅氏電化學發光法檢測試劑盒(鄭州大學第一附屬醫院檢測)平行檢測60份臨床血清，以聯合檢測試紙條檢測濃度作為橫坐標(X軸)，羅氏電化學發光法檢測試劑盒檢測濃度作為縱坐標(Y軸)，進行線性回歸分析對兩種方法進行比較。

2 結果

2.1檢測時間的確定 實驗結果見圖2、3。由圖可觀察到熒光強度隨時間的變化而增大，14 min后T/C值趨于平穩，選擇15 min作為最適檢測時間。

圖2 CA15-3最適檢測時間結果Fig.2 Results of CA15-3 best detection time

圖3 HE4最適檢測時間結果Fig.3 Results of HE4 best detection time

2.2標準曲線 用雙對數數學模型進行擬合，以標準品濃度的對數值為橫坐標，以T/C值平均數的對數值為縱坐標，建立各自的標準曲線方程，HE4標準曲線方程y=0.441 5x-1.785 6，R2為0.987 2；CA15-3標準曲線方程y=0.418 2x-2.170 7，R2為0.985 9，見圖4、5。

圖4 HE4 的標準曲線Fig.4 Standard curve for HE4

圖5 CA15-3的標準曲線Fig.5 Standard curve for CA15-3

2.3線性范圍與最低檢出限 測得HE4線性范圍為15.6～1 500 pmol/L，最低檢出限為14.33 pmol/L，CA15-3線性范圍為7.8～500 U/ml，最低檢出限為5.00 U/ml。

表1 批內與批間變異系數Tab.1 Result of coefficient of variation fluorescence immunchromatography

2.5特異性 HE4和CA15-3同時檢測，準確率均在90%以上，見表2，表明該方法同時檢測HE4和CA15-3不存在相互干擾。

表2 HE4和CA15-3干擾實驗理論值與真實值的比較Tab.2 Comparison of theoretical and measured values of HE4 and CA15-3 interference experiments

三種特異性質控品的檢測，準確率均在90%以上，表明該方法與CA12-5、CA19-9、CEA不發生交叉反應，試劑抗干擾能力較強，見表3。

表3 特異性質控品檢測理論值與真實值的比較Tab.3 Comparison of theoretical and real values of specific quality control products

2.6方法學比對 分別用兩種方法對60份樣本進行檢測，結果如圖6、7所示，兩種檢測方法的HE4相關方程為Y=0.924 9x+6.738，R2=0.953；CA15-3相關方程Y=0.913 5x-0.682 4，R2=0.956 3。表明本方法制備的HE4、CA15-3聯合檢測免疫層析試紙條檢測HE4、CA15-3分別與羅氏電化學發光電化學發光法。

圖6 HE4熒光免疫層析法與電化學發光法的相關性分析Fig.6 Correlation analysis between HE4 fluorescence immunochromatography and electrochemiluminescence

圖7 CA15-3熒光免疫層析法與電化學發光法的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between CA15-3 fluorescence immunochromatography and electrochemiluminescence

3 討論

一種腫瘤標記物含量的變化可出現在多種腫瘤內，一種腫瘤的發展也可以有多種標記物含量的變化[14]。表現了腫瘤標志物、腫瘤的非特異性。由于檢測單一的腫瘤標志物的結果并不理想，聯合檢測多個腫瘤標志物來提高靈敏度、準確度等檢測指標，為診斷提供更有力的支撐。腫瘤標記物在乳腺癌診斷、預后判斷、復發轉移預測以及治療效果的評估方面發揮廣泛的作用。CA15-3是乳腺癌常用的腫瘤標志物，近年發現HE4在乳腺癌癥診斷方面也發揮重要作用[15]。雖然張藝等[16]和吳英松等[17]利用 Eu3+作為標記物、96孔板作為固相載體建立了單獨檢測 HE4和CA15-3時間分辨熒光免疫分析的方法，但該方法需進行洗滌等一系列繁瑣的操作步驟，檢測時間長，不適應床旁快速檢測。羅朝領等[18]申請了基于上轉換發光的婦科腫瘤標志物CA125、CA153、SCCA、HE4芯片檢測系統及試劑的專利，未表明其檢測方法的性能指標，而且除了試紙條外，還需要反應檢測杯，增加了產品成本，也不利于推廣應用。

本研究用雙抗體夾心法與熒光免疫層析技術相結合的方法，建立了基于時間分辨熒光免疫層析的雙組分聯合檢測方法，具有一次檢測，高靈敏、短時間內同時檢測兩種標志物，且互不干擾的特點。其原理為血清中的待測標志物，在層析作用下,與免疫微球微球墊上的各自微球標記單抗結合，形成其“熒光微球-抗體-抗原”復合物,在硝酸纖維素膜的虹吸作用下，經過包被膜，與膜上各自的配對單抗結合,15 min 后檢測，從而實現HE4、CA15-3定量檢測。在優選實驗條件下，HE4在15.6～1 500 pmol/L范圍內，成線性相關，最低檢出限為14.33 pmol/L，CA 15-3在7.8～500 U/ml范圍內，成線性相關，最低檢出限為5.00 U/ml，相關系數均大于0.98。批內精密性與批間精密性均小于15%，與常見的腫瘤標志物 (CA12-5、CA19-9、CEA) 均無交叉反應，CA15-3與HE4兩組分同時檢測無交叉干擾，準確度均在90%以上；與羅氏電化學發光檢測試劑盒檢測結果對比，相關系數均在95%以上。臨床上HE4、CA15-3檢測方法主要為酶聯免疫法和電化學發光法，未出現關于HE4和CA15-3聯檢的熒光免疫層析的產品。這兩種方法檢測時間較長，配套檢測儀器昂貴并且要求專業人員操作，不利于在基層和社區醫院廣泛推廣使用。本研究建立了一種精密性好、簡便、快速、能滿足床旁快速定量檢測的HE4、CA15-3熒光免疫層析聯合檢測方法，具有潛在的臨床應用價值。進一步研究將增加生產批次，研究其穩定性，加大檢測的樣本數量，為其應用于臨床打下基礎。