介導巨噬細胞極化的關鍵轉錄因子及其與TLRs信號的相關性①

馬 玉 郭 豪 常曉彤

(河北北方學院臨床檢驗診斷學重點實驗室，張家口 075000)

巨噬細胞是天然免疫系統中的一個重要成員，其來源于骨髓的造血干細胞，后者首先在外周血中分化為成熟的單核細胞，再轉運到機體的大部分組織中，發育為巨噬細胞。基于巨噬細胞的可塑性和激活方式的不同[1]，可將其分為經典活化型巨噬細胞(classical activated macrophage,即M1型)和選擇性活化型巨噬細胞(alternative activated macrophage,即M2 型)[2]，M1為促炎表型，M2為抗炎表型，當應對不同的微環境信號時，巨噬細胞可在M1表型和M2表型間迅速轉變[3]，以發揮其促炎或抗炎作用。巨噬細胞的極化過程依賴于許多關鍵轉錄因子的調控，在不同疾病中，相關轉錄因子可直接或間接作用于目標基因的調控區域，促進促炎或抗炎細胞因子的表達，驅使巨噬細胞功能表型極化。

巨噬細胞對非己成分的識別是固有免疫應答的重要事件。巨噬細胞可表達多種模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)，其中Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)是重要的一類。TLRs可識別病原生物的病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)[4]和內源性的危險相關分子模式(danger-associated molecular patterns,DAMPs)[5]。目前，在哺乳動物中，共發現13種TLRs，其中已確認的人類TLRs家族成員有10個，即TLR1～TLR10[2]。巨噬細胞的TLRs通過識別非已成分，啟動其信號轉導通路，參與病原體的清除或在無菌炎癥下修復受損的細胞和基質以維護組織完整性及其功能[6]。調控巨噬細胞極化的關鍵轉錄因子與TLRs通路存在交互作用，影響巨噬細胞的極化過程和表型。本文對此作一綜述，以期為TLRs和巨噬細胞的相關研究提供理論參考。

1 巨噬細胞極化

巨噬細胞功能廣泛，在應答各種環境或病理環境變化時，巨噬細胞可經歷不同表型的極化，獲得不同的功能表型。M1型巨噬細胞由粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colonystim-ulating factor,GM-CSF)、脂多糖(lipopolysacch-aride,LPS)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)等誘導激活，可分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1、IL-6、活性氮和活性氧中間體等促炎因子和趨化因子，通過其分泌，激活適應性免疫應答，發揮專業抗原提呈細胞的作用，殺滅病原微生物，破壞腫瘤惡性細胞等[7]。M2型巨噬細胞可由巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)誘導活化。根據刺激物的不同， M2型巨噬細胞可進一步分為不同的亞型：在IL-4、IL-13的刺激下，可誘導成M2a型巨噬細胞，分泌精氨酸酶1 (Arginase1,Arg 1)和IL-10；在免疫復合物和 IL-1受體的配體等刺激下可誘導成M2b型巨噬細胞，其特點是高表達IL-10，低表達IL-12、IL-1β 和 TNF-α；在IL-10、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)或糖皮質激素的激活下可誘導成M2c型巨噬細胞，可分泌IL-10、甘露糖受體(CD206)、TGF-β等[8]。M2型巨噬細胞具有較低的抗原呈遞能力和抗炎作用，可下調適應性免疫應答，與寄生蟲感染、組織重塑和腫瘤進展有關[9]。

2 介導巨噬細胞極化的關鍵轉錄因子及與TLRs信號的關系

既有研究表明，巨噬細胞極化依賴于轉錄因子的介導[10]，如信號轉導子和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription，STATs)、干擾素調節因子(interferon-regulatoryfactor，IRFs)、核因子-κB(nuclear factor，NF-κB)、激活蛋白1(activator protein 1，AP-1)、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)、cAMP反應元件結合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CREB)、Krüppel樣因子4(krüppel-like factor 4,KLF4)等，這些關鍵的轉錄因子的激活，控制著巨噬細胞M1-M2的極化方向，使向M1表型傾斜或向M2表型傾斜[11]。在巨噬細胞極化過程中，TLRS對極化調節發揮著重要的作用。

2.1STATs STATs是一組廣泛表達于哺乳動物不同類型細胞和組織中的、能夠與目的基因調控區DNA結合的轉錄因子，目前共發現8種亞型[12]。活化的STATs參與巨噬細胞極化，而STATs的活化依賴于一類可溶性的酪氨酸蛋白激酶(Janus kinases，JAKs)，形成JAK/STAT信號通路。在巨噬細胞極化過程中，巨噬細胞的活化因子可導致受體相關的JAKs激活，STAT在JAK作用下發生酪氨酸磷酸化并二聚化，二聚化的STAT轉移到細胞核內，結合目的基因的啟動子序列并激活相應基因的轉錄[13]。JAK/STAT信號通路通過對應的細胞因子受體傳遞來自IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-13等活化因子的信號，活化不同的STATs，產生不同的生物學應答。IFN-γ與巨噬細胞表面IFN-γ受體(IFN-γR)結合激活STAT1，導致促炎細胞因子的產生，使巨噬細胞傾向M1表型。而IL-4、IL-10和IL-13經JAK/STAT通路，使巨噬細胞傾向M2表型，IL-4與巨噬細胞表面的IL-4受體(IL-4R)結合激活STAT3和STAT6；IL-10與巨噬細胞表面的IL-10受體(IL-10R)結合激活STAT3；IL-13與巨噬細胞表面的IL-13受體(IL-13R)結合既能活化STAT3和STAT6，也能活化STAT1，但前者處于優勢狀態，因此，IL-4、IL-10和IL-13使巨噬細胞傾向M2型[9]。

在分子水平，STAT1和STAT3/6活化的平衡，緊密調控著巨噬細胞的極化和功能，經IL-4誘導STAT6活化的巨噬細胞可抑制經IFN-γ誘導STAT1活化的巨噬細胞的極化。TLRs信號通路與JAK/STAT通路存在交叉對話，兩者相互作用，影響M1-M2巨噬細胞極化。巨噬細胞經IFN-γ極化后，對TLR4配體的促炎癥應答增強，表明IFN-γ/JAK/STAT通路與TLR4通路在STAT1水平上存在匯集[14]。已知在大多數丙型肝炎患者中，丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)持續感染并難以清除，有研究發現造成該結果的一個重要原因是HCV核心蛋白抑制了單核細胞向巨噬細胞的極化，其分子機制是HCV核心蛋白通過活化TLR2后，抑制了下游信號分子STAT1和STAT3的磷酸化，從而M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞的極化均受到抑制，導致M1和M2巨噬細胞功能紊亂，吞噬活性降低[15](圖1)。

圖1 STATs對巨噬細胞極化的影響及與TLRs的相關性Fig.1 Effect of STATs on macrophage polarization and correlation with TLRs

2.2IRFs IRFs是一類對IFN基因表達起調控作用的轉錄因子，能與Ⅰ型干擾素啟動子區域的病毒應答元件結合，激活IFN-α的表達，目前在哺乳動物中共發現9種亞型。IRFs的N-端區有保守的DNA結合域，它們具有顯著的同源性，在C-端區除了IRF6外均有IRF關聯域(IRF-association domains，IADs)，可與其他亞型的IRF相互作用。巨噬細胞的極化受IRFs的影響，其中IRF1、IRF5和IRF8主要參與促炎M1型巨噬細胞的極化，IRF3和IRF4主要參與抗炎M2型巨噬細胞的極化[16]。IRF4和IRF5除上述結構外，在IAD1和C-末端之間還有調控域和抑制區，被磷酸化激活時，可將抑制區轉化為活化區，參與巨噬細胞極化反應[17]。TLRs信號通路影響IRFs介導的巨噬細胞極化，發現經IFN-γ極化的巨噬細胞，在應答TLR4配體的刺激時，IRF8表達增高，促炎性細胞因子表達進一步增強，表明IFN-γ通路和TLR4信號通路在IRF8水平匯集，促進M1巨噬細胞表型[18]。IRF4與TLRs的一個重要接合子——髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)結合后，對TLRs信號的促炎癥活性起到負調節的作用，而IRF5則可增強依賴TLRs誘導的TNF-α、IL-6、IL-12等細胞因子的產生，在巨噬細胞極化中，IRF4與IRF5競爭結合MyD88，向NF-κB、AP-1和其他炎癥因子傳遞TLRs的不同激活信號，從而使促炎和抗炎達到平衡狀態[19](圖2)。

2.3NF-κB 在無活性的巨噬細胞內，核轉錄因子NF-κB與其抑制蛋白IκB結合，以無活性的異二聚體的形式存在于胞質內。當IκB被磷酸化后，NF-κB去抑制，游離的NF-κB轉移至細胞核內，調控炎癥、免疫應答等相關基因的表達。TLRs可識別特定的配體，除了TLR3外的TLRs均可導致NF-κB的激活[20]。細胞因子或PAMPs/DAMPs通過結合細胞表面TLRs，啟動NF-κB介導的信號級聯反應[1，21]。當巨噬細胞TLRs應答特定配體的刺激時，在多數情況下，NF-κB活化后，上調促炎癥基因的表達，使巨噬細胞傾向M1表型。但由于產生的NF-κB亞基組成存在兩種形式，即促炎癥反應的p65/p50 M1型和抗炎癥反應的p50/p50 M2型，當NF-κB以p65/p50的形式活化時，促炎細胞因子產生增加，形成M1表型；如果NF-κB以p50/p50的形式活化時，抗炎細胞因子產生增加，形成M2表型。所以，TLRs在應答LPS等的刺激時，能夠轉換巨噬細胞表型，產生M2型細胞因子，這是調節巨噬細胞可塑性的機制之一，有利于對感染和微環境的變化迅速作出應答[1，22](圖3)。

圖3 NF-κB對巨噬細胞極化的影響及與TLRs的相關性Fig.3 Effect of NF-κB on macrophage polarization and correlation with TLRs

2.4AP-1 在哺乳動物細胞中，轉錄因子激活蛋白AP-1主要是由c-Jun和c-Fos組成的同源c-Jun/c-Jun或異源c-Jun/c-Fos二聚體復合物，是多種細胞信號傳導途徑在細胞核內的交匯點，能夠調控諸多與細胞分裂、增殖、炎癥等相關基因的轉錄，是細胞增殖、分化、凋亡的關鍵決定因素之一。

在巨噬細胞內，TLRs或IL-1受體通過偶聯MyD88，啟動MAPKs信號級聯放大反應，激活巨噬細胞中的AP-1，進而AP-1通過激活細胞因子的產生來調節炎癥反應，TLRs或IL-1受體/MyD88/MAPKs/AP-1通路是巨噬細胞調節炎癥過程的一條重要通路；c-Jun因子是構成AP-1的核心成分，比c-Fos因子，對巨噬細胞的活化更為關鍵[23]。AP-1受磷酸化調控，負責c-Jun磷酸化的酶是c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)，JNK是MAPKs家族成員之一，當細胞受到不同的刺激(如Th1或Th2細胞因子的刺激)，JNK磷酸化c-Jun的不同位點，發揮正向或負向調節作用，促進或抑制抗炎基因的表達。在促炎因素的誘導下，AP-1誘導促炎基因的表達，有研究表明，巨噬細胞中JNK的活化是肥胖引起胰島素抵抗和炎癥的必要條件[24]。AP-1轉錄因子也參與了LPS介導的巨噬細胞活化等炎癥過程，同時AP-1的激活可與NF-κB協同作用，促使巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，起到促炎作用[25](圖4)。

圖4 AP-1對巨噬細胞極化的影響及與TLRs的相關性Fig.4 Effect of AP-1 on macrophage polarization and correlation with TLRs

2.5PPAR-γ PPAR-γ是一種配體激活的轉錄因子，屬于核激素受體超家族，PPAR-γ在巨噬細胞中表達豐富，是巨噬細胞脂質代謝的主要調節因子，可通過多種機制抑制促炎基因的表達[26]。

IL-13和IL-4可誘導PPAR-γ的表達；PPAR-γ可協同STAT6促進單核細胞向M2型巨噬細胞極化；在肥胖或炎癥應激時，PPAR-γ可導致脂肪組織巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化；當PPAR-γ基因敲除時，在M1型巨噬細胞分泌的炎性因子IL-1β和TNF-α作用下，炎癥和胰島素抵抗進一步增強[27-29]。PPAR-γ與TLRs下游信號分子 NF-κB密切相關，越來越多的證據表明，大黃酚等藥物活性分子的抗炎作用是通過PPAR-γ依賴的NF-κB的失活實現的[28，29](圖5)。

2.6CREB和KLF4 CREB是一種選擇性結合cAMP反應元件(cAMP response element,CRE)的核蛋白,含堿性亮氨酸拉鏈結構，其被蛋白激酶A(PKA)磷酸化后而活化，它的存在能刺激基因轉錄,故又被稱為轉錄增強因子。研究發現，CREB能夠通過誘導抗炎細胞因子IL-10的產生，增強M2型巨噬細胞的極化；前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)通過活化cAMP/PKA/CREB途徑，阻斷M1巨噬細胞的極化，促進了M2巨噬細胞極化，所以，在急性營養過剩的情況下，巨噬細胞的CREB抑制了促炎因子的產生，有助于維持胰島素的敏感性[30](圖5)。

KLF4是一種含鋅指結構的轉錄因子，發現在IL-4誘導的巨噬細胞活化過程中，STAT6的活化可激活KLF4，KLF4能夠驅動許多M2表型基因的表達，且能夠協同CREB，共同發揮抗炎應答作用[30]。在單核細胞向巨噬細胞極化的過程中，KLF4能夠使載脂蛋白E(apolipoprotein E,apoE)基因啟動子活性增高并誘導其表達，在CREB存在下，此作用進一步增強；apoE在脂代謝過程中具有重要作用，apoE缺陷可導致血漿中致動脈粥樣硬化脂蛋白清除受阻，故KLF4可能是一個潛在的治療動脈粥樣硬化的新靶標；另外，TLRs通路活化產生的LPS和TNF-α等促炎因子是誘導巨噬細胞中KLF4表達的關鍵因素之一，進而使KLF4誘導抗炎因子表達，以維持內環境的穩態[31](圖5)。

圖5 PPAR-γ、CREB和KLF4對巨噬細胞極化的影響及與TLRs的相關性Fig.5 Effect of PPAR-γ,CREB and KLF4 on macrophage polarization and correlation with TLRs

綜上，IFN-γ和LPS等促炎因子使巨噬細胞傾向M1表型，在轉錄因子STAT1、IRF1/IRF5/IRF8、p65/p50NF-κB和AP-1等作用下，促進促炎相關基因的表達，這些促炎因子使巨噬細胞更加傾向M1表型，形成促炎正反饋機制；同樣，IL-4、IL-10和TGF-β等抗炎因子使巨噬細胞傾向M2表型，在轉錄因子STAT3/6、IRF3/IRF4/、p50/p50NF-κB、PPAR-γ、CREB和KLF4等作用下，誘導更多抗炎因子的表達，這些抗炎因子使巨噬細胞表型進一步向M2轉移，形成抗炎正反饋機制；不同的轉錄因子間存在協同作用或反饋調控作用以調節極化方向；活化的TLRs信號通路可通過影響轉錄因子的活性，從而影響巨噬細胞極化方向。

上述這些轉錄因子介導的巨噬細胞極化參與了許多感染性疾病和炎癥性疾病的發生、發展和轉歸。巨噬細胞極化機制復雜，TLRs存在嗜性差異，未來的研究應全面探索不同疾病介導巨噬細胞極化的轉錄因子表達譜，明確和轉錄因子交集的TLRs信號通路中的信號分子，以此挖掘相關疾病的治療新靶點。