鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制作用

王 靜，刁翠茹，王華麗，李 祥，汪名春，王 浩,*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.國家食品安全風險評估中心標準三部，北京 100022；3.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036）

糖尿病是常見的、有遺傳傾向的內分泌系統疾病，隨著人們生活方式的改變，糖尿病的發病率逐漸上升，且發病人群日趨年輕化，糖尿病作為21世紀全球最大的健康問題之一，已成為僅次于癌癥和心血管疾病的第三大疾病。II型糖尿病是糖尿病的主要形式，在高收入國家中II型糖尿病患者占糖尿病總患者87%～91%[1]。餐后高血糖濃度是II型糖尿病及其并發癥的主要特征之一，可通過抑制碳水化合物的吸收來控制。一些抗糖尿病藥物，如阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖，通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性發揮作用，其雖然有效地抑制了餐后血糖濃度的上升，但持續使用往往伴隨著不良的副作用，如脹氣、腹部不適、惡心、嘔吐、腸鳴及腹瀉等，且機體的藥物耐受性也會逐漸增強[2]。因此，從天然產物中篩選獲得更安全、高效的抑制劑，成為II型糖尿病治療的研究熱點。迄今為止，已有大量的研究報道了各種植物提取物通過抑制碳水化合物水解酶的活性來達到抗糖尿病的目的[3-4]。因此尋找天然的無副作用的α-淀粉酶抑制劑至關重要。

鼠尾草酸是一種從迷迭香中提取的油溶性多酚類雙萜化合物（圖l），具有高效、安全無毒、耐高溫等特性[5]。Ninomiya等發現鼠尾草酸等迷迭香提取物除了可以通過有效調節脂肪的吸收來控制人體質量從而達到減肥的目的外，還可以用于治療炎癥、消化不良、糖尿病等[6]。已有研究發現鼠尾草酸對α-淀粉酶具有良好的抑制作用[7]，但具體抑制機制尚不清楚，因此本實驗將針對鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制機制做進一步的研究。主要從酶學動力學、熒光猝滅以及分子模擬幾個方面研究鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制機理，以期為其在保健食品和醫藥領域的應用提供有益參考。

圖 1 鼠尾草酸結構式Fig. 1 Structural formula of carnosic acid

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠尾草酸（純度≥90%） 湖南先偉實業有限公司；豬胰腺α-淀粉酶 美國Sigma Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HWS24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；TP-114分析天平、UB-7 pH計 美國丹佛儀器有限公司；LF-1404019熒光光譜儀 美國Thermo Scientific公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1α-淀粉酶活力的測定

α-淀粉酶活力測定根據Adisakwattana等的方法[8]略作改動。100 μLα-淀粉酶液和50 μL不同質量濃度的抑制劑，于37 ℃預孵化10 min。然后加入100 μL的底物（可溶性淀粉溶液）使反應開始，5 min后加入750 μL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴10 min后使反應停止，取出后冰浴至室溫，取反應液稀釋，在540 nm波長處測定光密度值。

1.3.2 酶促反應動力學分析

酶促反應動力學的測定參照李波等的方法進行[9]。固定底物（可溶性淀粉）濃度，改變α-淀粉酶質量濃度，在不同α-淀粉酶質量濃度條件下測定酶促反應的初速率，并對體系中的α-淀粉酶質量濃度作圖，得到酶促反應速率-酶質量濃度曲線。固定α-淀粉酶質量濃度，改變底物質量濃度（[S]），確定鼠尾草酸對α-淀粉酶抑制的動力學類型。

1.3.3 熒光光譜測定

使用LF-1404019熒光光譜儀分析α-淀粉酶與鼠尾草酸的相互作用。用0.1 mg/mL的酶液與不同質量濃度（0、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）的鼠尾草酸混合，在280 nm波長處測定混合物的熒光強度。發射波長為300～450 nm，狹縫寬度為10 nm，掃描速率為960 nm/min[10-11]。

1.3.4 分子對接分析

采用分子對接模擬的方法預測鼠尾草酸與α-淀粉酶的結合模式和作用力[12]。α-淀粉酶蛋白結構從RCSB Protein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb）獲取，鼠尾草酸三維分子晶體由Sybylh1.1軟件畫出。在對接之前，鼠尾草酸配體與α-淀粉酶蛋白受體使用Discovery studio 3.5軟件的“Prepare Ligand tool”和“Prepare Protein tool”模塊默認設置進行處理，從消化酶晶體結構中去除水分子。用AutoDock 4.2分子模擬軟件對淀粉酶結合位點上的抑制配體進行自動分子對接研究[14]。本研究使用DS3.5軟件的CDOCKER進行酶蛋白與小分子的分子對接操作，并使用下列參數：Top Hits-10、Random Conformations-10、Orientations to Refine-10、Force field-CHARMm和Use Full Potential-False。

1.4 數據統計與分析

所有實驗均重復3 次，結果用平均值±標準差表示。采用Origin 8.0軟件進行繪圖與方程擬合。

2 結果與分析

2.1 鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制作用

鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制可以通過半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）來體現，即鼠尾草酸引起的α-淀粉酶活力損失50%的結果。以鼠尾草酸質量濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制抑制曲線[15]，結果如圖2所示，隨著鼠尾草酸質量濃度的增加，鼠尾草酸對α-淀粉酶活力的抑制呈明顯的質量濃度依賴性。

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圖 2 阿卡波糖和鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制活性Fig. 2 Inhibitory effect of acarbose and carnosic acid on α-amylase activity

抑制劑的IC50取決于酶的活力和來源、底物類型和濃度以及其他實驗條件（如反應時間、溫度、pH值等）[16-18]。本實驗采用pH 5.6作為α-淀粉酶的反應條件，研究鼠尾草酸對α-淀粉酶的活力的抑制作用。通過線性擬合計算出鼠尾草酸對α-淀粉酶的IC50為1.12 mg/mL，與陽性對照藥物阿卡波糖（IC50＝0.089 mg/mL）相比，鼠尾草酸對α-淀粉酶活性的抑制效果略低，但依然具有較強的抑制作用，可能作為潛在的α-淀粉酶抑制劑。

2.2 酶促反應動力學分析結果

2.2.1 鼠尾草酸的可逆與不可逆抑制

固定底物的濃度，在不同鼠尾草酸質量濃度（0、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）條件下測定酶促反應的初速率，以α-淀粉酶的質量濃度為變量并對其作圖[19]，得到的酶促反應速率-酶質量濃度曲線通過原點，如圖3所示。根據抑制劑與酶的結合方式不同，抑制劑對酶的抑制類型分為可逆抑制和不可逆抑制：當加入不可逆抑制劑時，速率直線不通過坐標原點，與Y軸有一正截距；當加入可逆抑制劑時，速率直線通過坐標原點，斜率較不加抑制劑時低。由圖3可以看到，加入鼠尾草酸后的速率直線通過了坐標原點，依此推測鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制為可逆性抑制。

圖 3 鼠尾草酸對α-淀粉酶的可逆性抑制作用Fig. 3 Reversible inhibition of carnosic acid against α-amylase

2.2.2 鼠尾草酸對α-淀粉酶的酶促反應動力學分析結果

以可溶性淀粉作為底物分析鼠尾草酸對α-淀粉酶的酶促反應動力學。固定α-淀粉酶的質量濃度，在不同鼠尾草酸質量濃度（0、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）下，改變底物的質量濃度，測定不同底物質量濃度下反應體系的反應速率，得到α-淀粉酶在有無鼠尾草酸存在時的Lineweaver-Burk曲線（圖4）。

圖 4 鼠尾草酸對α-淀粉酶的雙倒數曲線Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for the inhibition type of carnosic acid against α-amylase

Michaelis常數Km和最大反應速率Vmax由公式（1）計算得到。由表1可知，與無抑制劑相比，在添加鼠尾草酸后，α-淀粉酶催化可溶性淀粉的反應方程中Km增大，而Vmax基本保持不變，因此推測鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制作用類型屬于競爭性抑制。

式中：Km是當酶反應速率達最大反應速率一半時的底物質量濃度/（mg/mL）；Ki為抑制劑常數；[I]表示抑制劑的質量濃度/（mg/mL）；[S]表示底物質量濃度/（mg/mL）；V表示酶的反應速率/（mol/（Lgmin））；Vmax表示最大反應速率/（mol/（Lgmin））。

表 1 鼠尾草酸對α-淀粉酶抑制的Vmax和KmTable 1 Vmax and Km values of carnosic acid for inhibiting α-amylase

2.3 鼠尾草酸對α-淀粉酶的熒光猝滅效應

蛋白質熒光主要來自色氨酸殘基，而α-淀粉酶分子含有至少16 個色氨酸殘基，因此淀粉酶色氨酸殘基的天然熒光強度及其變化值可直接反映蛋白質本身和周圍環境的變化[20]。實驗結果如圖5所示（鼠尾草酸的質量濃度從曲線a～j分別為0、0.062 5、0.125、0.175、0.25、0.35、0.5、0.8、1.0、2.0 mg/mL）。由熒光光譜中可以看出，隨著鼠尾草酸質量濃度的增加，α-淀粉酶的熒光強度逐漸降低，熒光光譜發生明顯猝滅現象。熒光強度的降低表明，經鼠尾草酸處理后會引起α-淀粉酶疏水鍵的斷裂，導致色氨酸等非極性氨基酸殘基暴露于極性環境中[21]。同時，最大發射波長從348 nm到340 nm，有微弱的藍移，表明鼠尾草酸與α-淀粉酶相互作用導致色氨酸的極性變化和本征熒光強度的猝滅。

圖 5 不同質量濃度的鼠尾草酸對淀粉酶熒光光譜的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of carnosic acid on fluorescence spectrum of α-amylase

2.4 結合常數等相關參數的分析結果

式中：F0與F分別為未加入與加入猝滅劑后體系的熒光發射強度；[Q]為猝滅劑質量濃度/（mg/mL）；Kq為熒光猝滅速率常數；τ0是不存在猝滅劑時物質的熒光平均壽命，一般生物大分子的熒光平均壽命為1h10-8s。

利用公式（2）對圖5中數據進行線性擬合計算，可得Kq為1.1h1011L/（molgs）。此Kq大于最大散射碰撞猝滅速率常數2h1010L/（molgs），因此進一步確定鼠尾草酸猝滅α-淀粉酶的過程不是由分子碰撞引起的動態猝滅，而是形成復合物的靜態猝滅過程[23]。

如果熒光劑與猝滅劑之間存在靜態猝滅，可根據雙對數回歸曲線（公式（3））計算出結合位點n。

式中：[P0]為α-淀粉酶的質量濃度/（mg/mL）；Ka為熒光與猝滅劑的表觀結合常數；n為結合位點數；[Q0]為鼠尾草酸的質量濃度/（mg/mL）。

將圖5中數據代入公式（3），經線性擬合后計算可得n≈1.114 1（表2），說明鼠尾草酸與α-淀粉酶所形成的復合物中二者的比例接近1∶1，暗示α-淀粉酶上可能只有一個鼠尾草酸結合位點。

表 2 鼠尾草酸對α-淀粉酶的熒光參數Table 2 Fluorescence parameters of α-amylase in the presence of carnosic acid

2.5 分子對接分析結果

由上述研究可知，鼠尾草酸與α-淀粉酶發生可逆的競爭性抑制，且鼠尾草酸與α-淀粉酶只有一個結合位點，因此可以推測鼠尾草酸競爭性結合在α-淀粉酶的活性中心。為了進一步確定鼠尾草酸在α-淀粉酶上的結合情況，進行了鼠尾草酸與α-淀粉酶的分子對接分析。結果如圖6所示。作為競爭性抑制劑，鼠尾草酸可逆地結合到酶變構位點上，擾亂了α-淀粉酶的構象動力學，形成可逆的酶-抑制劑復合物，減少了底物與酶的結合。為進一步查看鼠尾草酸與α-淀粉酶作用的微環境，列出了結合位點附近對結合作用貢獻較大的氨基酸殘基（圖6B），分別是Leu162、Gln63、Tyr62、Asp300、Gly306、Ser105、Ala198、His101、Tyr151、Val163、Ile235和Glu233，其中鼠尾草酸與Tyr151在空間上非常靠近。鼠尾草酸通過結合到Tyr151附近的疏水腔，引起周圍氨基酸殘基微環境發生變化，導致Tyr151周圍包埋度增加，空間結構更加嚴密，從而表現出α-淀粉酶內源熒光的猝滅變化。

圖 6 鼠尾草酸與α-淀粉酶的分子對接Fig. 6 Molecular docking model for carnosic acid with α-amylase

圖 7 α-淀粉酶與鼠尾草酸相互作用的相應氨基酸殘基Fig. 7 Amino acid residues for interaction between α-amylase and carnosic acid

從圖7中可以看出，鼠尾草酸和α-淀粉酶之間形成了兩個氫鍵。鼠尾草酸苯環上酚羥基的一個氧原子與附近氨基酸殘基Glu233形成氫鍵，鼠尾草酸羧基上的氧原子與附近氨基酸殘基Tyr151形成氫鍵，從而提高了鼠尾草酸-酶蛋白復合物的穩定性。Tyr151和Glu233為α-淀粉酶中催化活性中心的關鍵殘基，這意味著鼠尾草酸能夠與淀粉競爭α-淀粉酶的活性區域及改變酶的結構，并與活性中心殘基形成氫鍵，從而會導致α-淀粉酶的催化效率降低[24]，這與上述實驗結果是一致的，也是鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制機理。

3 討 論

糖尿病是一種由高血糖引起的慢性疾病，高糖飲食會導致血糖水平迅猛上升。膳食淀粉水解是血液中葡萄糖的主要來源，α-淀粉酶是淀粉分解和腸道吸收的關鍵酶，能催化淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、糖原和各種麥芽糊精的α-D-1,4-糖苷鏈，使其斷裂成較短的低聚糖，其他的淀粉酶也參與了淀粉的分解過程，但是α-淀粉酶的貢獻是這個過程開始的先決條件[25]。抑制α-淀粉酶活性可以有效控制血糖濃度，是治療糖尿病的有效方法之一。α-淀粉酶抑制劑通過抑制α-淀粉酶的活性阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，從而降低血糖水平[26]。α-淀粉酶已經作為治療糖尿病的一個靶點，用來控制碳水化合物的消化和低聚糖的吸收[27]。多酚類、黃酮類物質如茶多酚、苦蕎提取物等作為α-淀粉酶的抑制劑已經被廣泛研究[28-29]。鼠尾草酸作為一種脂溶性天然抗氧化劑應用范圍廣泛，已用于油脂及含脂食品、生物醫藥、化工、化妝品和飼料等方面，除了可以延緩油脂或含油食品的氧化，提高食品的穩定性和延長貯存時間外，還具有良好的生理和藥理活性[5]。從天然來源產物中尋找有效的α-淀粉酶抑制劑，對糖尿病的防治具有重要意義。

本研究探討了鼠尾草酸對α-淀粉酶的抑制作用，并采用熒光光譜法和分子對接研究了兩者之間相互作用的機理。酶促動力學研究結果顯示，鼠尾草酸對α-淀粉酶活性的抑制具有明顯的濃度依賴性，且鼠尾草酸以可逆的競爭性抑制方式與α-淀粉酶的活性位點結合，這與Sheng Zhanwu等的研究結果[7]相一致。當蛋白質和某些小分子發生反應時，體系的熒光性質會發生改變[30]。α-淀粉酶最大吸收波長在280 nm附近，主要由色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）側鏈的光吸收引起，其波長或吸收強度變化可反映Trp和Tyr殘基所處微環境的改變。鼠尾草酸對α-淀粉酶的熒光譜圖結果顯示，隨著鼠尾草酸質量濃度的增加，其對α-淀粉酶的內源性熒光猝滅程度越來越強，通過對實驗數據的計算可知，鼠尾草酸與α-淀粉酶之間存在一個結合位點，競爭性地與α-淀粉酶的活性中心結合，形成鼠尾草酸-α-淀粉酶復合物，從而抑制了α-淀粉酶的活性。同時，采用分子對接的方式模擬鼠尾草酸與α-淀粉酶的結合，結果發現鼠尾草酸與底物競爭性地結合在酶的活性中心。有研究表明鼠尾草酸是良好的供氫體，其苯環上含有兩個羥基，苯環上的電子離域作用使酚羥基容易發生離子化，氫鍵在鼠尾草酸與α-淀粉酶的結合過程中發揮了有很大的作用[30]。鼠尾草酸通過與周圍氨基酸殘基發生相互作用，觸發變構調節，使酶的構象發生紊亂，從而導致α-淀粉酶催化活性降低。

綜上所述，鼠尾草酸能夠很好地抑制α-淀粉酶的活性，從而阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取。為鼠尾草酸深層次研發利用提供理論依據。迷迭香作為一種天然的綠色植物，含有大量的活性成分，現代藥理研究表明，該類成分多數具有降血糖、抗氧化和心血管等方面作用，對其進行深入研究，有望將其開發成為新一代治療心腦血管系列疾病的藥物[31]。迷迭香提取物作為一種天然抗氧化劑，由于其安全、高效的抗氧化性和較好的熱穩定性，具有巨大的應用潛力。