Helveticin-M與綠原酸復配對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌的抑菌效果及其機制

王虹懿，劉 芳，孫芝蘭,*，蘇萌萌，諸永志，王道營，徐為民，彭 景*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州 225127；3.江蘇省農業科學院農產品質量與營養安全研究所 省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇 南京 210014）

肉類是人類日常膳食中優質蛋白質的主要來源之一，營養十分豐富，但其高營養成分極易被微生物利用從而影響其食用品質和安全性[1]。在屠宰、運輸、加工和貯藏過程中，以肉品為傳播媒介的致病性細菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等已在雞肉、豬肉、牛肉及其他肉類食品中被檢出[2-3]，嚴重危害消費者健康，是引發食源性疾病的主要原因之一。因此避免微生物的污染及抑制其在肉品中的生長繁殖是控制和保障肉品質量安全的關鍵所在。

目前控制禽畜肉類微生物的主要措施仍是添加化學防腐劑，在健康意識越來越強的今天，由于化學防腐劑存在諸多缺陷，其高殘留、高毒性等化學副作用使常見化學防腐劑受到越來越多消費者的排斥，因此現今食品安全加工工業更加傾向使用天然防腐劑。細菌素是蛋白類抑菌物質，作為微生物的代謝產物，是潛在的天然食品生物防腐劑，因其具有無毒、無副作用、無殘留、無抗藥性的特性而受到食品行業的青睞[4]。目前研究最徹底并獲得美國食品藥品監督管理局批準為食品防腐劑的細菌素——乳酸鏈球菌素（Nisin），已作為食品添加劑在全球范圍內得到廣泛應用[5]；但其抗菌譜較窄，因為外膜的存在使得Nisin不能到達作用位點而對革蘭氏陰性細菌抑菌作用很小[6]。為了抵消這種影響，許多研究將細菌素與其他抑菌劑復配使用，有效地抑制了食品中腐敗菌的生長。如將Nisin、茶多酚和殼聚糖進行復配并應用于肉類食品的保存中，發現Nisin、殼聚糖之間存在明顯協同作用[7-8]，并能有效延長肉品的貨架期；Nisin與ε-多聚賴氨酸、乳鐵蛋白等新抗菌劑結合使用能夠協同控制食物中的腐敗菌[9-10]。

Helveticin-M是卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）K313代謝合成的廣譜高效細菌素，本課題組前期已建立Helveticin-M的異源表達及提取純化方法，分析了該細菌素的抗菌活性和作用機理，確定其在肉制品防腐應用中的潛力[11]，但Helveticin-M抑菌譜較窄，如何降低其在肉品中的使用濃度以及節約成本仍是亟待解決的問題。綠原酸是具有抑菌活性的天然植物源生物防腐劑[12]，目前，許多研究表明從植物中提取和分離的綠原酸對多種腐敗菌具有一定的抑制效果[13-16]。本實驗將微生物源生物防腐劑細菌素與植物源生物防腐劑綠原酸進行復配，研究III型細菌素Helveticin-M和綠原酸協同處理對指示菌（大腸桿菌、腸炎沙門氏菌）的抑菌效果及其作用機制，闡明二者協同作用抑制革蘭氏陰性菌的作用機理，為開發新型有效食品防腐劑及預防食源性疾病抑菌物質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Helveticin-M由江蘇省農業科學院農產品加工研究所畜禽組前期構建在大腸桿菌中異源表達，并分離純化；指示菌株（大腸桿菌、腸炎沙門氏菌）從冷鮮雞肉中自主分離獲得。

LB培養基（1.5%瓊脂粉、1%氯化鈉、1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物，均為質量分數） 實驗室自制；綠原酸（杜仲提取物，純度98%） 陜西慧科植物開發有限公司；LIVE/DEADTMBacLightTM熒光染色試劑盒美國Invitrogen公司；增強型ATP檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

JY5002型電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；UniCenMR臺式高速冷凍離心機 德國Herolab公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；JS-600W電泳儀、JS-680C凝膠成像系統 上海培清科技有限公司；超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Gen5全波長酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；Ultra View VOX激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM） 美國珀金埃爾默公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國Carl Zeiss公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與培養

將從雞肉樣品中分離得到的指示菌大腸桿菌、腸炎沙門氏菌接種于LB平板培養基中，37 ℃培養12 h。挑取典型的單菌落接種于新鮮LB液體培養基中，于37 ℃搖床培養（200 r/min）生長至對數期，按體積分數2%的接種量再次轉接于新鮮LB液體培養基中，活化傳代2 次備用。

1.3.2 Helveticin-M的表達、分離及純化

挑取構建好的pCNCH-Helveticin-M單菌落接種于帶有氨芐抗性（Amp+）的LB液體培養基中。37 ℃、200 r/min培養過夜，按體積分數2%接種于500 mL LB（Amp+）抗性培養基中繼續培養至OD600nm＝0.8時，加入1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷于22 ℃誘導培養過夜。菌液誘導表達后12 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌2 次，將沉淀重懸于50 mL結合緩沖液中，利用細胞破碎儀進行超聲破碎，破碎后的樣品于12 000 r/min下離心20 min，收集上清液，利用標準鎳柱純化方法純化、透析，收集Helveticin-M備用[17]。

1.3.3 Helveticin-M與綠原酸復配處理對指示菌生長曲線的影響

活化得到的指示菌按體積分數2%接種于LB液體培養基中，分別添加純化的Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M與綠原酸復配溶液，使其終質量濃度分別為200 μg/mL[16]、2.5 mg/mL[18]和200 μg/mL Helveticin-M+2.5 mg/mL綠原酸，作為處理組。以相同體積的LB液體培養基作為對照組。將菌液于37 ℃靜置培養，每隔1 h測定OD600nm，實驗重復操作3 次，每次設置3 個平行，記錄并繪制生長曲線。

1.3.4 活菌數的測定

將活化后的大腸桿菌和腸炎沙門氏菌按體積分數2%接種于LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min搖床培養至對數期（OD600nm值為1.0左右）時，4 ℃、12 000 r/min離心3 min，無菌收集菌體沉淀，用5 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）懸浮菌體，分別取1 mL菌懸液置于不同離心管中，分別添加與1.3.3節相同終質量濃度的Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M與綠原酸復配溶液，作為處理組。以加入相同體積的PBS作為對照組。將菌懸液放入37 ℃、200 r/min搖床培養，分別培養0、10、20、60、120、180 min時取樣，使用生理鹽水按照10 倍遞增稀釋法稀釋樣品至相應菌體濃度，分別取100 μL各稀釋樣品均勻涂布于LB固體平板上，30 ℃培養24 h后記錄菌落總數（lg（CFU/mL））[19]。實驗重復3 次，每次重復設置3 個平行，結果取平均值。

1.3.5 細胞形態的觀察

按1.3.4節步驟制備對照組和處理組細菌懸液。將上述所有樣品于37 ℃、200 r/min搖床培養3 h，取出菌液于6 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集菌體，PBS沖洗2 次，加入體積分數2.5%的戊二醛緩沖液固定。于4 ℃ 2 500 r/min離心4 min，加超純水靜置10 min后按上述條件再次離心，重復操作3 次；用體積分數50%、70%、80%、90%乙醇溶液對樣品進行梯度洗脫，每次靜置15 min；6 000 r/min離心2 min后加入無水乙醇靜置30 min，再次離心，重復操作3 次。最后將樣品固定于鏡片上，通風櫥中風干、噴金，采用SEM觀察并采集圖像[20]。

1.3.6 細胞膜通透性分析

1.3.6.1 胞外ATP濃度測定

通過測定指示菌細胞外ATP濃度變化，分析不同抑菌物質對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌細胞膜通透性的影響[21]。按1.3.4節步驟制備對照組和處理組細菌懸液。將上述所有樣品于37 ℃、200 r/min下搖床培養，分別在培養0、10、20、30、60、90、120 min時取樣，12 000 r/min離心10 min后取上清液置于冰上暫存待用。參照增強型ATP檢測試劑盒說明書要求處理樣品，用化學發光酶標儀檢測熒光值，計算ATP濃度。實驗重復操作3 次，每次重復設置3 個平行。

1.3.6.2 CLSM檢測

使用熒光探針SYTO-9和碘化丙啶（propidium iodinate，PI）按照一定比例調配染色，分別用于標記活體細胞和死細胞。取按1.3.4節步驟制備的對照組和處理組細菌懸液各100 μL，10 000 r/min離心2 min，收集菌體，PBS重懸，加入LIVE/DEADTMBacLightTM試劑盒中的熒光染料3 μL進行染色，37 ℃黑暗孵育30 min后6 000 r/min離心5 min，收集菌體，PBS沖洗，重復操作3 次，最終將菌體懸浮在200 μL PBS中。吸取2～3 μL菌液于玻片，在CLSM下用100 倍油鏡觀察并拍照[22]。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用最小顯著差異法進行分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M與綠原酸復配處理對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌生長的影響

圖1顯示了單獨添加Helveticin-M、綠原酸及將二者復配后處理對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌生長的影響。與未添加抑菌物質的對照組相比，用Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M+綠原酸復配溶液處理后，兩株指示菌生長均受到抑制，其中復配處理組的生長抑制效果最明顯。由圖1A可知，對照組大腸桿菌經過前3 h的生長遲緩期后，菌體進入對數生長期，培養至12 h時菌體進入穩定期。綠原酸和Helveticin-M單獨處理組大腸桿菌的生長速率受到一定抑制，復配處理組大腸桿菌在培養7 h時菌體濃度才明顯上升，至培養12 h時其OD600nm僅為1.331，明顯低于對照組和單獨處理組，說明Helveticin-M+綠原酸復配處理更為明顯地抑制了大腸桿菌的生長。由圖1B可知，對照組腸炎沙門氏菌在培養0～2 h處于生長遲緩期，培養2 h后進入對數生長期。而經過不同抑菌處理后，3 組腸炎沙門氏菌生長遲緩期均延長了1 h，隨著培養時間的延長，復配處理組腸炎沙門氏菌生長受到的抑制最為明顯，培養12 h時OD600nm僅為1.235。

圖 1 Helveticin-M、綠原酸或Helveticin-M綠原酸復配溶液處理的大腸桿菌（A）和腸炎沙門氏菌（B）的生長曲線Fig. 1 Growth curves of E. coli (A) and S. enteritidis (B) in the presence of Helveticin-M and/or chlorogenic acid

2.2 Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M與綠原酸復配處理對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌活菌數的影響

由圖2可知，與對照組相比，2.5 mg/mL綠原酸單獨處理3 h后，大腸桿菌和腸炎沙門氏菌活菌數分別下降約30.1%、21.2%；經200 μg/mL Helveticin-M單獨處理3 h后，大腸桿菌和腸炎沙門氏菌活菌數分別下降約44.4%和37.4%；Helveticin-M+綠原酸復配處理3 h后，大腸桿菌腸活菌數下降約74.1%，腸炎沙門氏菌活菌數下降約61.7%，與單一抑菌劑相比抑菌效果更明顯。說明Helveticin-M與綠原酸復配時增強了殺菌效果。

圖 2 Helveticin-M、綠原酸或Helveticin-M綠原酸復配處理對大腸桿菌（A）和腸炎沙門氏菌（B）活菌數的影響Fig. 2 Effects of Helveticin-M and/or chlorogenic acid on viability of E. coli (A) and S. enteritidis (B)

2.3 Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M與綠原酸復配處理對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌細胞形態結構的影響

圖 3 Helveticin-M、綠原酸或Helveticin-M綠原酸復配處理前后大腸桿菌（A）和腸炎沙門氏菌（B）的SEM圖Fig. 3 SEM images of E. coli (A) and S. enteritidis (B) before and after treatment with Helveticin-M and/or chlorogenic acid

通過SEM觀察不同抑菌處理對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌形態結構的影響。如圖3所示，未經處理的對照組指示菌細胞完整且獨立，細胞膜平滑，細胞體飽滿圓潤。200 μg/mL Helveticin-M處理后，大腸桿菌菌體細胞出現少量塌陷，胞膜表面變得褶皺不平整，呈現皺縮狀態；腸炎沙門氏菌失去圓滑的圓桿狀，形態變得輕微不規則。2.5 mg/mL綠原酸處理后，大腸桿菌菌體表面粗糙，有少許程度的扭曲凹陷，腸炎沙門氏菌菌體相互堆疊。Helveticin-M+綠原酸復配處理后，2 種指示菌菌體開始出現溶脹、扭曲，細胞表面粗糙加重、褶痕變多，形態嚴重遭到破壞，大腸桿菌和腸炎沙門氏菌胞外均有明顯的內容物泄漏，腸炎沙門氏菌菌體表面出現明顯的孔洞，細胞膜受損最為嚴重。以上結果表明，Helveticin-M與綠原酸復配作用后明顯改變了指示菌細胞的外部結構和形態，對細胞質膜結構的破壞效果明顯，造成胞膜組分溶解，胞內物質大量析出，從而抑制菌株的生長。

2.4 Helveticin-M、綠原酸和Helveticin-M與綠原酸復配處理對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌細胞膜通透性的影響

2.4.1 CLSM觀察結果

圖 4 Helveticin-M、綠原酸或Helveticin-M綠原酸復配處理前后大腸桿菌（A）與腸炎沙門氏菌（B）的CLSM圖Fig. 4 CLSM E. coli (A) and S. enteritidis (B) before and after treatment with Helveticin-M and/or chlorogenic acid

用熒光染料對菌體進行染色后，通過LSCM觀察熒光顏色變化情況，進而確定不同抑菌條件處理對細胞膜通透性的影響[23]。經SYTO-9和PI兩種熒光染料染色后，SYTO-9能夠進入具有完整細胞膜結構的細胞，呈現綠色熒光，而PI作為一種核酸染料，僅能進入受損及死亡細胞，并與DNA或RNA結合后產生紅色熒光[24]。因此，染色后完整的細胞顯示綠色熒光，破損的細胞則顯示為紅色熒光。如圖4所示，對照組和經Helveticin-M或綠原酸單獨作用后，2 種指示菌大部分菌體呈綠色熒光，僅能觀察到少量黃色和紅色熒光；依據圖像中受損細胞數量計算得到，大腸桿菌經Helveticin-M或綠原酸單獨處理后細胞受損率分別為5.33%和40.00%，腸炎沙門氏菌細胞受損率分別為13.25%和20.75%。經過Helveticin-M與綠原酸協同作用后，2 種指示菌中呈紅色熒光的細胞數量明顯增多，說明細胞膜受損嚴重，依據圖像中受損細胞數量計算得到，Helveticin-M+綠原酸復配處理30 min大腸桿菌的細胞受損率達到73.68%，腸炎沙門氏菌的細胞受損率為58.46%，且觀察到復配處理后紅色熒光細胞的熒光強度高于對照組中綠色熒光強度，這與上述不同處理方式對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌活菌數的影響結果相對應。CLSM觀察結果表明，對照組與單獨處理組樣品中絕大多數菌體細胞的細胞膜完整，經復配處理后，隨著細胞膜完整性被破壞及通透性增加，PI透過受損細胞膜進入細胞與SYTO-9競爭取代結合位點，呈現紅色熒光。

2.4.2 胞外ATP濃度檢測結果

圖 5 Helveticin-M、綠原酸或Helveticin-M綠原酸處理對大腸桿菌（A）和腸炎沙門氏菌（B）的胞外ATP濃度的影響Fig. 5 Extracellular ATP levels of E. coli (A) and S. enteritidis (B) in the presence of Helveticin-M and/or chlorogenic acid

由圖5可知，經不同抑菌條件處理后2 種指示菌胞外ATP濃度均在短時間內均發生一定程度的泄漏。與對照組相比，Helveticin-M、綠原酸及二者復配處理20 min后，胞外ATP濃度均有所增加且漸趨穩定。對于大腸桿菌菌株，2.5 mg/mL綠原酸處理2 h后，胞外ATP濃度為128 nmol/mL，相比之下，200 μg/mL Helveticin-M處理2 h后胞外ATP濃度升高至160.52 nmol/mL，而Helveticin-M與綠原酸協同作用后細菌胞外ATP在30 min內迅速增加至172.7 nmol/mL，培養2 h后增加至310.47 nmol/mL。而對于腸炎沙門氏菌，培養2 h內，對照組和綠原酸處理組胞外ATP濃度變化不明顯，基本保持在20 nmol/mL內，Helveticin-M處理組胞外ATP濃度增加至46.71 nmol/mL，而用Helveticin-M與綠原酸協同處理誘導細胞內大量ATP泄漏，培養2 h后細菌胞外ATP濃度增加至94.15 nmol/mL，表明Helveticin-M與綠原酸協同作用使細胞膜通透性明顯增加，胞內物質泄漏加劇。

3 討 論

由于許多天然抗菌劑的最小抑菌濃度較高，有的僅在極高濃度下才能達到抑菌效果，而將單個細菌素與其他抗菌劑聯合作用后抑菌效果明顯增強[25]，協同作用后將具有較大的應用潛力。

本實驗首先研究了由卷曲乳桿菌產生的III型細菌素Helveticin-M（200 μg/mL）、綠原酸（2.5 mg/mL）和兩者復配對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌的抑菌作用，發現Helveticin-M與綠原酸協同作用可增強二者的抑菌活性和殺菌活性。二者復配處理后細菌活菌數在3 h內分別下降約0.5和0.27 個對數級，這可能是因為二者對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌主要表現為抑菌作用而非殺菌作用。一些非熱處理方法也可對指示菌造成亞致死損傷[11]，抑制它們的生長，但這種亞致死細胞能在良好環境條件（營養、水分、pH值和溫度）中恢復。為了抵消這種影響，可以與其他物理方法（如超聲波或高強度脈沖電場）聯合作用，進一步殺死食品中的致病菌。

其次，通過SEM進一步檢測大腸桿菌和腸炎沙門氏菌的細胞形態發現，Helveticin-M和綠原酸復配處理后指示菌細胞膜損傷和胞內物質泄漏更為明顯，推測二者協同作用造成指示菌株細胞膜的損傷，使細胞膜通透性增加。研究表明，綠原酸可作用于革蘭氏陰性菌如大腸桿菌的脂多糖層，改變細胞外膜的通透性[26]。位于革蘭氏陰性菌細胞膜和肽聚糖層外的外膜層是阻擋細菌素（如Nisin）到達細胞膜的屏障，使得細菌素不能到達作用位點從而影響其抑菌效果[27]。CLSM觀察結果與胞外ATP濃度測定結果表明，綠原酸可能破壞了指示菌外膜，幫助Helveticin-M嵌入指示菌細胞膜并形成孔洞，導致內膜通透性增加，進而引起胞內物質泄漏，這也與已報道的ε-多聚賴氨酸、Nisin和乳酸3147之間所表現出的協同作用相似[28-30]。利用多種防腐劑協同作用能夠高效控制微生物的生長增殖，這是因為不同的防腐劑具有不同的作用位點，它們同時作用于目標指示菌時，可建立多重破壞指示菌的方式。另外，抗菌劑的協同使用能夠加強抗菌劑的效果，減少抗菌劑的最低有效劑量，節約使用成本[31]。

4 結 論

Helveticin-M和綠原酸對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌具有協同抑制作用，Helveticin-M和綠原酸協同發揮作用既能高效抑制大腸桿菌和腸炎沙門氏菌的生長，又能降低使用抑菌劑時的質量濃度。Helveticin-M與綠原酸復配主要是通過破壞大腸桿菌和腸炎沙門氏菌細胞膜，增加細胞膜通透性，導致胞內物質泄漏來抑制細菌的正常生長。Helveticin-M和綠原酸協同作用是一種新型的抗菌組合，可以用于食品工業中肉制品的保存，為之后進一步探究“柵欄技術”在食品安全中的應用提供理論支撐。