渦流空化改善大豆分離蛋白溶解性的分子間作用機制

任仙娥，李春枝，楊 鋒，黃永春，閻柳娟

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

大豆蛋白氨基酸組成合理，含有能降低膽固醇、預防心血管疾病的生理活性成分，并具有良好的加工性能以及較低的成本，常作為重要的食品配料廣泛應用于食品行業(yè)[1]。大豆分離蛋白是一種重要的商用大豆蛋白產品，主要成分為大豆球蛋白和β-伴球蛋白，這些蛋白組分在生產加工過程中受到酸沉、高溫的影響，極易發(fā)生變性，變性后的蛋白質進一步聚集形成大的聚集體甚至沉淀，導致商用大豆分離蛋白的溶解性較差[2]。蛋白質的大部分功能性質都與溶解性有關，低溶解性使得很多功能性質也變差。商用大豆分離蛋白的低溶解性極大地限制了它在食品工業(yè)中的應用[3]。因此，很多物理、化學和生物學方法都被用來改性大豆蛋白以提高其溶解性，進而改善其功能性質[4-6]。

空化技術是一項食品物理加工新技術。在空化過程中，空化泡潰滅的瞬間會產生局部極端瞬時高溫、高壓，并伴有強烈的沖擊波、微射流、湍流、高剪切力，同時還產生自由基等效應，這些效應能誘導或加速一些物理化學反應的發(fā)生[7-8]。目前常用的空化方式有超聲空化和水力空化[9]。Ashokkumar[10]、O’Sullivan[11]和白復笑[12]等研究表明，超聲空化能破壞蛋白質分子之間的相互作用，使蛋白質的構象發(fā)生變化、大的聚集體解聚、分子結構部分展開、表面疏水性增加，進而使部分功能性質得到改善。本課題組前期研究結果表明，基于渦流的水力空化能使大豆分離蛋白粒徑減小，表面疏水性增加，二級結構發(fā)生變化，溶解性可由處理前的（45.23f2.48）%增加至（89.24f1.81）%，與此同時，其乳化性和起泡性等功能性質也得到很大改善[13-14]。蛋白質的溶解性和功能性質與其構象密切相關，而蛋白質的構象是通過離子鍵、氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用等分子間作用力來維持的[15]。本實驗進一步研究渦流空化引起的大豆分離蛋白分子間作用力的變化，并分析它與溶解性改善之間的關聯(lián)，來探討渦流空化改善大豆分離蛋白溶解性的作用機制，為水力空化技術在蛋白質改性領域的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白（蛋白質量分數(shù)≥90%）購于山東禹王生態(tài)食品有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Avanti J-26 XPI高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；BSA224S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell垂直電泳系統(tǒng) 美國伯樂公司。

渦流空化實驗裝置由實驗室自制，其結構示意圖見圖1，由儲液罐、壓力表、渦流泵、閥門和管道組成。流體從儲液罐流經(jīng)渦流泵，再回到儲液罐。渦流泵中電機驅動葉輪旋轉，當流體流經(jīng)旋轉的葉輪時，產生漩渦，導致中心壓力降低，當壓力低于液體的蒸汽壓時，空化泡產生，隨著葉輪的旋轉，空化泡又被甩出，當壓力增大時，空化泡破滅，產生空化效應。

圖 1 渦流空化裝置圖Fig. 1 Schematic diagram of swirling cavitation

1.3 方法

1.3.1 渦流空化處理大豆分離蛋白

用去離子水將大豆分離蛋白粉末配成3 g/100 mL的分散液，待其充分溶解后，倒入儲液罐中，開啟冷卻水，開啟渦流泵，調節(jié)壓力，分別在0.2、0.4、0.6 MPa下處理不同時間（5、10、30、60 min）。經(jīng)處理后的樣品凍干后備用。

1.3.2 還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

還原十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參照Jiang Lianzhou等[16]的方法，配制質量分數(shù)13%的分離膠、4%的濃縮膠。將蛋白質樣品稀釋至3 mg/mL，取40 μL稀釋后的蛋白液與80 μL樣品緩沖液（3.55 mL去離子水、1.25 mL 0.5 mol/L pH 6.8的Tris-HCl、2.5 mL甘油、2.0 mL 10 g/100 mL SDS和0.2 mL 0.5 g/100 mL溴酚藍混合均勻后于室溫下貯存，使用時取出950 μL與50 μLβ-巰基乙醇混合），混合均勻后于95 ℃下加熱5 min，冷卻后上樣，上樣量為10 μL。電泳時蛋白質樣品在濃縮膠中電流為16 mA，進入分離膠后將電流調為28 mA。電泳結束后，先對其進行固定，然后采用考馬斯亮藍R250染色，再進行脫色，直至出現(xiàn)清晰的蛋白條帶為止，最后使用凝膠成像系統(tǒng)進行成像處理。

1.3.3 分子間作用力的測定

參照Tan[17]和劉書成[18]等的方法，略作修改，具體操作步驟如下：取0.6 g樣品加入20 mL S1（0.6 mol/L NaCl），充分攪拌溶解后于10 000 r/min離心10 min后取出上清液。再向所得沉淀中加入20 mL S2（1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液），充分攪拌溶解后于10 000 r/min離心10 min后取出上清液。再向所得沉淀中加入20 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液），充分攪拌溶解后于10 000 r/min離心10 min后取出上清液。再向上述所得沉淀中加入20 mL S4（0.5 mol/Lβ-巰基乙醇、8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl的混合液，pH 7）充分攪拌溶解后于10 000 r/min離心10 min后取出上清液。向上述每一步離心所得上清液中分別加入等體積的20 g/100 mL三氯乙酸，于10 000 r/min離心10 min，棄上清液，向所得沉淀中（包括未溶于S4的沉淀）分別加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液，利用Lowry法測定其蛋白質含量[19]。以溶解于S1的蛋白質含量占總蛋白質含量的比例來表示離子鍵含量，以溶解于S2的蛋白質含量占總蛋白質含量的比例來表示氫鍵含量，以溶解于S3的蛋白質含量占總蛋白含量的比例來表示疏水相互作用的強弱，以溶解于S4的蛋白質含量占總蛋白質含量的比例來表示二硫鍵含量，以經(jīng)S4提取后最終所得沉淀的蛋白質含量占總蛋白質含量的比例來表示非二硫共價鍵含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

每個實驗均重復3 次，結果表示為平均值±標準差，利用SPSS 21軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan法進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，相關性分析采用Pearson分析。

2 結果與分析

2.1 渦流空化對大豆分離蛋白分子質量分布的影響

大豆蛋白的主要成分為大豆球蛋白和β-伴球蛋白。大豆球蛋白由一個酸性多肽和一個堿性多肽通過二硫鍵連接，β-伴球蛋白由α、α’和β3 個亞基組成[1]。為了判斷大豆分離蛋白經(jīng)渦流空化處理后其溶解性的改善是否由蛋白質的水解引起，取出經(jīng)渦流空化處理時間較長（30 min和60 min）的樣品，通過還原SDS-PAGE來說明渦流空化是否引起大豆分離蛋白肽鍵的斷裂導致其分子質量發(fā)生變化。

圖 2 渦流空化對大豆分離蛋白分子質量分布的影響Fig. 2 Effect of swirling cavitation on molecular mass distribution of SPI

由圖2可以看出，不同壓力下渦流空化處理30 min和60 min后均未引起大豆蛋白各條帶的變化，無小分子質量條帶的產生，說明渦流空化處理并未使大豆分離蛋白的肽鍵斷裂，所以溶解性的改善不是由蛋白質的水解引起的。Hu Hao等[20]在研究超聲波對大豆分離蛋白理化性質的影響時也發(fā)現(xiàn)不同功率的超聲波處理能改善大豆分離蛋白的溶解性，但是并不引起肽鍵的斷裂，因此其認為超聲波處理后大豆分離蛋白溶解性的改善不是由蛋白質的水解引起的，而是由構象的變化引起的。O’Sullivan等[21]也報道過相似的結論。

2.2 渦流空化對大豆分離蛋白分子間作用力的影響

2.2.1 渦流空化對大豆分離蛋白離子鍵含量的影響

圖 3 渦流空化對大豆分離蛋白離子鍵含量的影響Fig. 3 Effect of swirling cavitation on the content of ionic bonds in SPI

由圖3可知，大豆分離蛋白在未處理時離子鍵含量為（18.34f0.95）%，經(jīng)渦流空化處理后離子鍵含量顯著增加（P＜0.05）。隨著處理時間的延長離子鍵含量不斷增加，在不同壓力下處理60 min后，離子鍵含量分別達到（44.93f1.66）%（0.2 MPa）、（56.04f2.75）%（0.4 MPa）和（68.02f4.26）%（0.6 MPa）。前期研究結果表明，經(jīng)渦流空化處理后，大豆分離蛋白高級結構被破壞，一些大的聚集體解聚，平均粒徑降低，分子結構部分展開，更多的帶電氨基酸殘基暴露于分子表面[13]，這有利于離子鍵的形成。Jambrak等[22]研究發(fā)現(xiàn)，超聲空化能改變乳清蛋白的高級結構，也使帶電氨基酸殘基數(shù)量增加，溶解性增加。

由圖3還可以看出，處理相同時間時，壓力越大離子鍵含量增加越明顯，這與空化現(xiàn)象的形成有關。更高的壓力使流體流經(jīng)渦流泵的速率更高，導致漩渦中心的壓力下降得更多，從而形成更多的空化泡，空化強度也更大[23]，蛋白質樣品的解聚程度更大，從而暴露出更多的氨基酸殘基，有利于離子鍵的形成。

2.2.2 渦流空化對大豆分離蛋白氫鍵含量的影響

圖 4 渦流空化對大豆分離蛋白氫鍵含量的影響Fig. 4 Effect of swirling cavitation on the content of hydrogen bonds in SPI

氫鍵是一種弱鍵，在維系和促進蛋白質構象形成，特別是在二級結構的形成中起著極其重要的作用[24]。由圖4可知，渦流空化處理對大豆分離蛋白氫鍵含量的影響與其處理壓力和時間有關。在空化壓力為0.2 MPa時，處理5 min后，氫鍵含量有所增加，但隨著處理時間繼續(xù)延長，氫鍵含量開始降低；在空化壓力為0.4 MPa時，氫鍵含量隨著處理時間的延長逐漸增加，但是處理時間超過30 min后，氫鍵含量顯著降低（P＜0.05）；在空化壓力為0.6 MPa時，氫鍵含量隨著處理時間的延長顯著降低（P＜0.05），處理60 min后氫鍵含量可由0 min時的（6.87f0.77）%減小到（2.88f0.39）%。劉書成等[18]研究表明，氫鍵對溫度比較敏感，溫度越高，氫鍵越弱，50 ℃的熱效應已經(jīng)能對氫鍵產生強烈的破壞作用。渦流空化過程中產生局部瞬時高溫等空化效應，會破壞氫鍵，導致氫鍵含量下降。同時，氫鍵斷裂使大豆分離蛋白發(fā)生解聚，高級結構被破壞，分子展開，更多的側鏈基團暴露出來，又可形成新的氫鍵。由此推測，渦流空化處理過程中氫鍵的斷裂和形成同時發(fā)生，而不同壓力產生的空化效應有所差別，導致氫鍵形成和斷裂的速率不同，所以渦流空化在不同壓力和處理時間下對氫鍵的影響不同。另外，前期的研究結果表明，渦流空化處理使大豆分離蛋白的二級結構發(fā)生變化，其中β-折疊含量增加，α-螺旋、β-轉角和無規(guī)卷曲含量均降低，但是增加和降低的幅度隨處理壓力和時間的不同而不同[13]。α-螺旋含量的降低意味著蛋白分子內部相鄰肽鏈之間的氫鍵受到破壞，而β-折疊含量的增加則說明又有新的氫鍵形成，這也說明了渦流空化處理過程中氫鍵的斷裂和形成同時發(fā)生。張文等[25]在研究超聲波對花生蛋白分子結構的影響時，發(fā)現(xiàn)超聲波的空化作用能破壞蛋白質分子內氫鍵，使其二級結構發(fā)生變化。齊寶坤等[26]發(fā)現(xiàn)熱處理能使大豆球蛋白分子中的氫鍵發(fā)生變化，導致其二級結構發(fā)生變化，進而影響其溶解性。

2.2.3 渦流空化對大豆分離蛋白疏水相互作用的影響

圖 5 渦流空化對大豆分離蛋白疏水相互作用的影響Fig. 5 Effect of swirling cavitation on the content of hydrophobic interaction in SPI

疏水相互作用是疏水基團為了避開水分子而被迫靠近的現(xiàn)象，它在維持蛋白質三級結構的穩(wěn)定和四級結構的形成中占有突出的地位[24]。由圖5可知，在空化壓力為0.2 MPa和0.4 MPa時，處理初期疏水相互作用增加，這是因為空化處理使蛋白質的結構展開，大的聚集體解聚，包埋在分子內部的疏水性氨基酸殘基暴露出來，有利于疏水相互作用的增加；但是隨著處理時間的繼續(xù)延長，疏水相互作用下降。而在0.6 MPa時，疏水相互作用則隨著處理時間的延長均顯著降低（P＜0.05）。在處理60 min后，所有經(jīng)過渦流空化處理后大豆分離蛋白的疏水相互作用均顯著低于未處理的（P＜0.05），可由未處理時的（34.55f1.86）%分別減小到（20.26f1.52）%（0.2 MPa）、（14.75f1.61）%（0.4 MPa）和（7.46f1.44）%（0.6 MPa）。這說明隨著處理時間的延長和壓力的增大，空化效應對疏水相互作用的破壞更強，所以雖然疏水基團暴露出來，但疏水相互作用還是降低的。Hu Hao等[20]在研究超聲波對大豆分離蛋白理化性質的影響時也發(fā)現(xiàn)，超聲空化產生的湍流、高壓和高剪切等空化效應也能破壞蛋白分子間的疏水相互作用，并且隨著超聲空化強度的增加和處理時間的延長，疏水相互作用的破壞增加，溶解性顯著增加。

2.2.4 渦流空化對大豆分離蛋白二硫鍵含量的影響

二硫鍵是蛋白質多肽鏈內或不同鏈間的兩個半胱氨酸殘基的巰基氧化形成的，它對蛋白高級結構的形成與穩(wěn)定起著重要作用[24]。由圖6可知，未處理的大豆分離蛋白二硫鍵含量為（24.16f1.14）%。與未處理的蛋白相比，渦流空化處理能顯著降低二硫鍵含量（P＜0.05），且隨處理壓力和時間的延長而降低，降低幅度隨著空化壓力的變化而不同，其中在0.6 MPa下二硫鍵含量降低最多。大豆分離蛋白溶液經(jīng)0.2、0.4 MPa和0.6 MPa處理60 min后二硫鍵含量分別為（12.57f1.13）%、（10.42f0.90）%和（10.34f2.21）%。二硫鍵含量降低的原因是渦流空化時產生的局部極端高溫、高壓、高剪切力和湍流等作用能使二硫鍵斷裂。文鵬程等[27]在研究不同處理條件對乳鐵蛋白構象的影響時發(fā)現(xiàn)，超聲空化處理能使乳鐵蛋白的二硫鍵含量降低33.7%；Hu Hao等[28]也發(fā)現(xiàn)超聲空化處理能使大豆分離蛋白的二硫鍵斷裂轉化為巰基，導致其平均粒徑也減小，溶解性增加；畢爽[29]和Petruccelli[30]等研究表明，二硫鍵的斷裂能使蛋白分子的構象發(fā)生改變，結構變得松散，更多的親水基團暴露出來，溶解性增加。

圖 6 渦流空化對大豆分離蛋白二硫鍵含量的影響Fig. 6 Effect of swirling cavitation on the content of disulfide bonds in SPI

2.2.5 渦流空化對大豆分離蛋白非二硫共價鍵含量的影響

圖 7 渦流空化對大豆分離蛋白非二硫共價鍵含量的影響Fig. 7 Effect of swirling cavitation on the content of non-disulfide covalent bonds in SPI

由圖7可知，渦流空化處理對大豆分離蛋白非二硫共價鍵含量的影響隨處理壓力的不同而不同。在0.2 MPa下非二硫共價鍵含量未發(fā)生顯著變化（P＞0.05）；在0.4 MPa下非二硫共價鍵含量隨處理時間的不同有不同程度的降低；在0.6 MPa下非二硫共價鍵含量在處理30 min后顯著降低（P＜0.05）。這說明渦流空化在較高壓力下產生的較強的空化效應能使大豆分離蛋白的非二硫共價鍵斷裂。姜梅等[31]在研究高壓均質對豆乳蛋白質溶解性的影響時發(fā)現(xiàn)高壓均質產生的高速剪切、空穴和渦旋作用也使共價鍵斷裂，蛋白質空間結構展開，水化作用增強，溶解性增加。

2.3 大豆分離蛋白溶解性與分子間作用力之間的相關性分析結果

為了探討渦流空化處理對大豆分離蛋白溶解性改善的分子作用機制，將前期研究得到的大豆分離蛋白在渦流空化處理過程中溶解性變化的數(shù)據(jù)[13]與本研究中圖3～7各分子間作用力變化的數(shù)據(jù)進行相關性分析，結果如表1所示。

表 1 大豆分離蛋白溶解性與各分子間作用力的相關性Table 1 Correlation analysis between intermolecular forces and solubility of SPI

大豆分離蛋白的溶解性與其離子鍵含量之間存在極顯著正相關（r＝0.754）（P＜0.01），與疏水相互作用和二硫鍵含量之間均極顯著負相關（P＜0.01），相關系數(shù)分別為-0.714、-0.839，與氫鍵含量和非二硫共價鍵含量無顯著相關（P＞0.05）。由此可見，大豆分離蛋白在渦流空化處理過程中，溶解性的增加是由離子鍵的形成、疏水相互作用的破壞和二硫鍵的斷裂引起的。

3 結 論

通過研究大豆分離蛋白在渦流空化處理過程中分子間作用力的變化，探討了溶解性改善與分子間作用力變化之間的關系，得到以下結論：1）渦流空化處理過程中，大豆分離蛋白溶解性的改善不是由肽鍵斷裂引起的；2）渦流空化處理使大豆分離蛋白的分子間作用力發(fā)生變化，其溶解性的改善是由離子鍵的形成、疏水相互作用的破壞和二硫鍵的斷裂引起的。