牛磺酸對抑郁癥模型小鼠的預防性干預作用

袁 靜，閆晨靜，周 茜，牛佳卉，吳夢穎，王亞旭，王 頡，趙 文*

（河北農業大學食品科技學院，河北省農產品加工工程技術中心，河北 保定 071001）

抑郁癥主要表現為心境持久低落，思維遲鈍，食欲缺乏和體質量減輕，意志行為減少，嚴重者出現自殺企圖或行為[1-2]，是一種在世界上廣泛流行的精神疾患[3]，全球各年齡層共有約3億 人患有抑郁癥。根據世界衛生組織的預測，抑郁癥的發病率每年增加113%，預計到2020年成為世界第二大疾病負擔[4]。但目前廣泛使用的抗抑郁藥物具有很大局限性，且長期使用會對人體產生一定的毒副作用，開發安全有效的預防抑郁癥藥物或通過營養干預緩解抑郁癥是當今社會亟待解決的問題。研究表明，從食物中提取的營養物質，比如乳源活性肽[5]、桔梗[6]、茯苓多糖[7]、小分子化合物（CXZ-123）[8]等都對抑郁癥有緩解作用。

牛磺酸作為體內含量最豐富的含硫氨基酸，以游離狀態存在[9]，是人體正常生理活動所必需的活性物質，牛磺酸不僅參與維持機體內環境穩態，而且在神經、心血管、免疫和內分泌等系統生理功能的正常發揮起著重要的調節作用[10]。牛磺酸作為一種機體的內源性抗損傷物質，已發現具有多種生理功能，但對其抑郁癥的干預作用鮮有研究，Wu Gaofeng等[11]對牛磺酸的抗抑郁作用進行研究，通過慢性溫和不可預知應激（CUMS）抑郁模型證明了牛磺酸具有抗抑郁作用。在目前的抗抑郁研究中，抑郁癥的動物模型建立方法主要包括應激模型和藥物誘導模型兩大類，本實驗利用兩種常用的抑郁模型——小鼠行為絕望模型和利血平誘導急性抑郁模型來探討牛磺酸的抗抑郁作用，為牛磺酸抗抑郁作用機制的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

ICR小鼠，SPF級，雄性，18～22 g，購于北京華阜康實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2009-0004。動物自然節律光照，適應3 d后進行實驗。

牛磺酸（純度≥99.9%） 上海康丁生物科技有限公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯免疫吸附分析試劑盒、多巴胺（dopamine，DA）酶聯免疫吸附分析試劑盒、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）酶聯免疫吸附分析試劑盒、單胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）酶聯免疫吸附分析試劑盒、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）酶聯免疫吸附分析試劑盒、促腎上腺皮質激素釋放因子（corticotropin-releasing factor，CRF）酶聯免疫吸附分析試劑盒、促腎上腺皮質激素（adreno-cortico-tropichormone，ACTH）酶聯免疫吸附分析試劑盒、皮質醇（cortisol，COR）酶聯免疫吸附分析試劑盒 上海源葉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Scientz-ⅡD型超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；1500-823型全波長掃描酶標儀 美國Thermo Scientific公司；SPX-250B型生化培養箱 北京鑫骉騰達儀器設備有限公司；3-18R型低溫（0～4 ℃）高速離心機 湖南恒諾儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 行為絕望小鼠模型

小鼠適應性喂養3 d，隨機分成6 組：陰性對照組（蒸餾水）、氟西汀對照組（氟西汀10 mg/kgmb）、牛磺酸低、中、高劑量組（天然牛磺酸0.5、1、2 g/kgmb），每組10 只。連續灌胃至第8天進行懸尾實驗，第9天進行強迫游泳實驗，第10天進行曠場實驗[12]。

1.3.2 利血平誘導的抑郁小鼠模型

小鼠適應性喂養3 d，動物分組與劑量設計同1.3.1節。連續灌胃14 d，最后一次灌胃30 min后陰性對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組腹腔注射利血平（2.5 mg/kgmb），1 h后觀察小鼠眼瞼下垂情況（分級判斷下垂度），3 h后測肛溫、出圈率[13]。

記錄小鼠體質量，摘眼球取血，頸椎脫臼處死動物，冰臺取腦組織并稱質量。分離血清、血漿，制備腦勻漿，測定血清ATCH、BDNF、血漿COR、腦勻漿5-HT、NE、DA、MAO、CRF水平。

1.3.3 行為學指標

1.3.3.1 眼瞼下垂

判斷眼瞼下程度。0 度：正常睜眼；1 度：眼瞼下垂1/4；2 度：眼瞼下垂1/2；3 度：眼瞼下垂：3/4；4 度：眼瞼完全閉合[14]。

1.3.3.2 肛溫

小鼠肛溫計探頭涂抹甘油后插入小鼠肛門1 cm處測量肛溫。

1.3.3.3 出圈率

將小鼠放入直徑7.5 cm的白紙圓圈內觀察15 s，計算每組小鼠的出圈率。

1.3.3.4 懸尾實驗

末次給藥60 min后，用醫用膠布將小鼠尾（在距尾尖1 cm處）[15]粘在高出桌面15 cm的橫桿上，使其呈倒立狀態，四周以板隔離小鼠視線。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，但活動一段時間后出現間隙性靜止，即顯示失望狀態。適應1 min后，記錄5 min內小鼠的累計不動時間。

1.3.3.5 強迫游泳實驗

末次給藥60 min后，將小鼠置于水溫20～25 ℃，水深10 cm的游泳水槽中，強迫游泳6 min，觀察并記錄后4 min內小鼠靜止時間。當小鼠呈漂浮狀態停止掙扎時記錄游泳不動時間（小鼠僅做輕微動作以保持頭部浮于水面上也視為游泳不動）[16]。

1.3.3.6 曠場實驗

采用紙質敞箱（50 cmh50 cmh50 cm），底面劃分為面積相等的25 個白色方格（10 cmh10 cm）。給藥60 min后將小鼠置于曠場內，觀察5 min內小鼠的活動情況，包括水平運動次數（三爪以上跨入鄰格次數）、垂直運動次數（兩前肢離地1 cm以上的次數，包括直立及攀附墻體）[17-18]。

1.4 數據處理

實驗數據以平均值±標準偏差表示，采用單因素方差分析及t檢驗對行為學觀測指標進行統計分析，本實驗所有統計分析數據差異的操作均用SPSS19.0統計軟件完成。組間比較采用單因素方差分析法：P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 牛磺酸對行為絕望小鼠干預作用

圖 1 牛磺酸對行為絕望小鼠干預作用的影響（n＝ 10）Fig. 1 Interventional effect of taurine on behavioral despair in mice (n = 10)

由圖1a可知，與陰性對照組相比，牛磺酸3 個劑量組懸尾不動時間分別降低了17.06%、47.22%、55.72%，其中低劑量組差異顯著（P＜0.05），中、高劑量組差異極顯著（P＜0.01），且效果略優于氟西汀（降低44.72%）；圖1b中與陰性對照組相比，氟西汀組小鼠強迫游泳不動時間縮短17.85%（P＞0.05）。牛磺酸中劑量組顯著降低21.69%（P＜0.05），高劑量組極顯著降低49.17%（P＜0.01）；小鼠曠場實驗圖1c中，與陰性對照組相比，牛磺酸中劑量組水平運動次數顯著升高21.45%（P＜0.05），高劑量組極顯著性升高28.41%（P＜0.01）；與氟西汀對照組相比，低、中劑量組豎直運動次數分別降低26.79%（P＜0.01）、18.96%（P＜0.05），表明牛磺酸在提高小鼠自主運動水平上與氟西汀對照組相似。

2.2 牛磺酸對利血平誘導抑郁模型小鼠體質量、腦質量的影響

表 1 牛磺酸對小鼠體質量和腦質量的影響（n＝ 10）Table 1 Effect of taurine on body mass and brain mass in mice (n= 10)

由表1可知，陰性對照組、模型組、氟西汀對照組小鼠相比，體質量、腦質量均無顯著性差異，表明抑郁對小鼠體質量、腦質量影響不大。表明牛磺酸對利血平誘導的抑郁模型小鼠體質量、腦質量無明顯影響。

2.3 牛磺酸對利血平誘導抑郁模型小鼠眼瞼下垂度、體溫、出圈率的影響

表 2 牛磺酸對小鼠眼瞼下垂度、體溫、出圈率的影響（n＝ 10）Table 2 Effect of taurine on ptosis, body temperature and escape rate of mice (n= 10)

由表2可知，與陰性對照組相比，模型組小鼠眼瞼下垂度、體溫均顯示出極顯著性差異（P＜0.01），表明抑郁模型建模成功。與模型組相比，牛磺酸組眼瞼下垂度無顯著性差異（P＞0.05），且牛磺酸對抑郁小鼠體溫無顯著性影響。與模型組相比，氟西汀對照組眼瞼下垂度、體溫顯示出極顯著性差異（P＜0.01），表明陽性藥物可以緩解利血平誘導的抑郁小鼠的抑郁表象特征。

2.4 牛磺酸對利血平誘導抑郁模型小鼠5-HT、DA、NE的影響

圖 2 牛磺酸對小鼠腦組織5-HT（a）、DA（b）和NE（c）含量的影響（n＝ 10）Fig. 2 Effect of taurine on 5-HT (a), DA (b) and NE (c) contents in brain tissues of mice (n = 10)

由圖2可知，與陰性對照組相比，模型組小鼠5-HT、DA、NE均分別極顯著下降（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，牛磺酸中劑量組DA、NE分別顯著上升20.46%、24.85%（P＜0.05），高劑量5-HT顯著上升19.09%（P＜0.05），DA、NE分別極顯著上升27.03%、30.66%（P＜0.01）。表明牛磺酸具有升高抑郁小鼠腦組織5-HT、DA、NE的作用。與氟西汀對照組比較，牛磺酸高劑量組與陽性藥物效果相當。

2.5 牛磺酸對利血平誘導抑郁模型小鼠MAO活力和BDNF含量的影響

圖 3 牛磺酸對小鼠MAO活力（a）、BDNF含量（b）的影響（n＝ 10）Fig. 3 Effect of taurine on MAO (a) and BDNF (b) contents in mice (n = 10)

如圖3所示，與陰性對照組相比，模型組小鼠MAO活力極顯著上升39.87%，BDNF含量極顯著下降33.97%（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，牛磺酸低、中、高劑量組MAO活力分別極顯著下降了9.42%、13.82%、16.77%（P＜0.01）。表明牛磺酸有降低抑郁小鼠MAO活力，并升高BDNF含量的作用，且高劑量組與氟西汀組接近。

2.6 牛磺酸對利血平誘導抑郁模型小鼠CRF、ACTH、COR含量的影響

圖 4 牛磺酸對小鼠血清CRF含量（a）、ACTH含量（b）和血漿COR含量（c）的影響（n＝ 10）Fig. 4 Effect of taurine on CRF (a), ACTH (b) and COR (c) content in serum of mice (n = 10)

如圖4所示，與陰性對照組相比，模型組小鼠CRF、ACTH、COR含量均極顯著上升（P＜0.01），表明造模成功。與模型組相比，牛磺酸低劑量組ACTH、COR含量分別顯著下降17.05%、20.90%（P＜0.05），中劑量組CRF、ACTH、COR含量分別極顯著下降11.07%、25.14%、25.49%，高劑量組CRF、ACTH、COR含量分別極顯著下降19.52%、27.40%、33.14%（P＜0.01）。表明牛磺酸可以降低抑郁小鼠CRF、ACTH、COR水平，與氟西汀對照組比較，高劑量組牛磺酸與其相似。

3 討 論

懸尾實驗和強迫游泳實驗是通過觀察實驗動物行為表現而對抗抑郁藥物進行篩選和評價。曠場實驗通過觀察記錄小鼠自主活動情況，提高了抗抑郁藥物篩選的可靠性。3 種行為學實驗綜合進行有利于全面考察抗抑郁藥的作用效果，被廣泛用于抗抑郁藥物的初篩。本研究結果發現，牛磺酸（1、2 g/kgmb）能夠顯著降低小鼠懸尾不動時間和強迫游泳不動時間，并增加小鼠自主運動水平，發現與氟西汀對照組的效果相當，且具有劑量相關性，說明牛磺酸可以有效縮短小鼠行為絕望時間，初步確定其可能具有一定的干預抑郁功效。

進一步采用對藥物誘發的抑郁動物模型的實驗研究，根據已知抗抑郁藥的基本藥理作用，建立藥物誘導作用的動物模型。通過藥物相互作用的抑郁動物模型，并對牛磺酸的抗抑郁作用性質進一步進行探討。利血平是一種吲哚型生物堿，研究發現，利血平具有鎮靜中樞神經的作用，長期使用利血平可引起單胺類神經遞質5-HT、DA、NE的耗竭，同時伴隨眼瞼下垂、體溫降低、身體僵直等臨床癥狀，與抑郁癥癥狀相同[19-21]。利血平誘導抑郁模型具有造模時間短、減少動物的痛苦和造模過程簡單的優點，是最早發展的抑郁動物模型[22]，現已廣泛應用于抑郁模型的建立。本實驗通過研究牛磺酸對利血平誘導小鼠急性抑郁模型影響，發現牛磺酸對小鼠眼瞼下垂、體溫下降、運動不能癥狀具有緩解作用。

抑郁產生機制十分復雜，目前為止，主要概括為以下幾種學說[23-25]：1）單胺類神經遞質假說：該假說認為抑郁癥是由于患者腦內中樞神經系統突出間隙DA、NE、5-HT等單胺類神經遞質濃度水平或功能下降所致[25-26]；2）受體假說：腦中單胺神經遞質受體敏感性增高引發抑郁癥，以5-HT受體功能改變為主[27-29]；3）神經內分泌假說：該假說包括下丘腦-垂體-腎上腺素軸（HPA）學說，主要表現為CRF含量升高，ACTH分泌增強，致使COR過度分泌，負反饋調節機制被破壞，進而引起前額皮質和海馬區神經元的凋亡，導致認知能力下降[30]；4）腦源性神經營養因子（BDNF）假說：該假說表明壓力會減少前額皮層和海馬區的BDNF的表達和功能，致使神經元萎縮，也會少抑郁癥患者血液中的BDNF水平[31-32]。單胺類神經遞質假說是目前最為公認的抑郁機制學說，該假說認為抑郁癥是由于患者腦內中樞神經系統突出間隙5-HT、DA、NE等單胺類神經遞質濃度水平或功能下降所致，研究報道可知5-HT是色氨酸代謝產物之一，對情緒與認知的調控起重要作用[33]。因此可通過測定單胺遞質水平直接判定抑郁程度。HPA亢進學說主要表現為CRF、ACTH、COR的過度分泌，負反饋調節機制被破壞，產生抑郁癥狀。而BDNF水平的下降也與神經元萎縮密切相關，是抑郁癥的重要檢測指標之一。本研究發現牛磺酸可對抗利血平誘導的急性抑郁模型小鼠5-HT、DA、NE含量下降，降低MAO活性與CRF、ACTH、COR的過渡分泌，升高BDNF水平的作用，推測牛磺酸干預抑郁作用機制與神經單胺遞質假說、神經內分泌假說和腦源性神經營養因子假說密切相關，牛磺酸抗抑郁的作用機制還不能完全闡明，對哪些信號通路具有干預作用，這些信號通路之間又是怎樣相互作用和相互聯系的需要進一步深入研究。

4 結 論

本研究發現牛磺酸可以有效縮短小鼠行為絕望時間，具有一定的干預抑郁功效。此外，牛磺酸一定劑量條件下還能夠緩解利血平誘導的小鼠抑郁，并明顯升高小鼠腦組織5-HT、DA、NE水平，降低MAO活性，并升高BDNF含量，同時抑制CRF、ACTH、COR的過度分泌，表明牛磺酸作為預防抑郁癥的膳食補充劑有良好的開發前景。