羅非魚頭磷脂對RANKL誘導RAW264.7細胞分化的抑制作用及其對破骨細胞凋亡作用的機理

馬 婷，夏光華，李 川，申鉉日*

（海南大學食品學院，海南 海口 570228）

骨組織平衡由成骨細胞調控的骨形成和破骨細胞調控的骨吸收共同維持[1]。破骨細胞是體內唯一負責骨吸收的細胞，遷移到骨吸收的位置，黏附到鈣組織上，形成褶皺區和空泡區，同時分泌質子和溶菌酶到褶皺區下方降解骨基質和膠原蛋白基質，形成骨吸收陷窩[2]。破骨細胞活性不斷增強會導致骨重建失衡，進而引發多種骨疾病，例如骨質疏松癥、類風濕性關節炎和畸形性骨炎[3]。抑制破骨細胞及破骨前體細胞分化是維持骨吸收和骨形成動態平衡的基本方式[4]。目前，許多雙膦酸鹽藥物以誘導破骨細胞凋亡作為主要的抗再吸收治療靶點。然而，它們具有一定的副作用，例如頜骨壞死和骨折風險增加[5]。因此，人們迫切希望尋找和開發治療骨基質代謝疾病的新型天然物質。

羅非魚是世界水產業重點養殖的淡水魚類，其加工產品以凍羅非魚片為主，在加工過程中產生大量魚頭、魚皮和魚骨等下腳料，而羅非魚頭中含有豐富的磷脂成分，可作為水產保健食品的原料進行開發利用[6]。磷脂是細胞膜的基本組成成分，具有抑制炎癥、調節血脂、改善記憶、延緩衰老等多種重要生理功能，這些生理活性與其脂肪酸組成和由磷酸相連的取代基團（含氨堿或醇類）的組成密切相關[7]。與陸生生物磷脂相比，水產生物體內的磷脂富含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等多不飽和脂肪酸，具有較高的營養價值[8]。近年研究發現磷脂具有治療骨疾病的生物學作用：Wu Zhou等[9]在小鼠骨髓細胞培養系統中發現磷脂酰絲氨酸脂質體能夠抑制破骨細胞的形成；Hartmann等[10]發現在外源性的補充卵磷脂后，大鼠對角叉菜膠性關節炎得到明顯的緩解。然而，鮮見關于水產動物磷脂對破骨細胞的分化與凋亡影響的報道。因此，本實驗選用羅非魚頭磷脂（tilapia head phospholipid，TH-PL），探討其對單核巨噬細胞RAW264.7分化成破骨細胞的影響，為TH-PL作為一種治療骨基質代謝疾病的新型功能性食品的應用提供科學依據，也為提高羅非魚的附加值并緩解環境污染問題提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚由海南翔泰漁業股份有限公司提供；RAW264.7細胞 北京協和細胞資源中心。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、25%胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；核因子κB受體活化因子受體的配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL） 美國Peprotech公司；DHA、噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）試劑盒、羅丹明123（Rhodamine 123，Rh123） 美國Sigma公司；Muse? Annexin V & Dead Cell試劑盒 德國Merck Millipore公司；Caspase-3抗體 美國Cell Signaling公司；GAPDH抗體 杭州賢至科技公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TENSOR27傅里葉變換紅外光譜儀（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR） 德國Bruker公司；SMP7多功能酶標儀 美國Bio-Rad Laboratories公司；Z326K低溫離心機 德國Hermle公司；MCO-175二氧化碳恒溫培養箱 日本Sanyo公司；CKX 41SF倒置顯微鏡 日本Olympus公司；6890N氣相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 TH-PL的制備

按照Chen Liping等[11]描述的方法提取羅非魚頭脂質并稍作修改。用自來水清洗羅非魚頭以去除魚鰓等雜質，組織粉碎機粉碎，真空冷凍干燥后進行下一步實驗。采用體積分數95%乙醇（料液比1∶10，m/V）在25 ℃下超聲提取1.5 h，重復萃取3 次。抽濾后，將濾液真空蒸發并濃縮至浸膏狀。通過氯仿-甲醇-水（8∶4∶3，V/V）溶液混懸上述脂質5 min以除去色素等雜質，然后在25 ℃、4 000 r/min離心10 min。收集氯仿層并加入0.2 倍體積的0.9 g/100 mL NaCl溶液，漩渦1 min以除去蛋白質。25 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集下層有機相并通過旋轉蒸發器濃縮，即為羅非魚頭的總脂質。將脂質溶于氯仿中，采用硅膠柱層析進行分離，用氯仿、丙酮和甲醇進行洗脫，洗脫劑與洗脫時間分別為：氯仿（0～15 min）、丙酮（15～30 min）、甲醇（30～40 min）；洗脫條件：進樣量2 mL，進樣質量濃度20 mg/mL，流速10 mL/min，檢測波長205 nm，監測波長210 nm。最終得到組分I（fraction I，Fr I）、II（fraction II，Fr II）、III（fraction III，Fr III）。

1.3.2 薄層色譜檢識

Fr III點樣于被酸處理的MF-254硅膠板上（pH 5），分別以氯仿-甲醇-水（65∶25∶4，V/V）溶液和Dittmer-Lester試劑為展開劑和顯色劑進行磷脂的薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）檢識[12]。

1.3.3 FTIR分析

將TH-PL涂抹于KBr薄片上。使用紅外光譜儀在4 000～500 cm-1進行光譜掃描，根據吸收峰的位置判斷磷脂的特征官能團。

1.3.4 脂肪酸分析

根據Cruz-Hernandez[13]和Lei Lin[14]等的方法，進行TH-PL的脂肪酸分析。將TH-PL甲基化，用正己烷溶解于進樣瓶，使用熔融CP-Sil 88石英毛細管柱（100 mh0.25 mm，0.2 μm）進行脂肪酸甲酯鑒定。氫氣作為載氣，流速為30 mL/min。程序性升溫總共持續86 min：起始溫度45 ℃，持續4 min；以13 ℃/min的速率升溫至175 ℃，持續27 min；然后升至215 ℃，速率為4 ℃/min，最后在215 ℃保持35 min。對比脂肪酸甲酯標準樣品色譜峰保留時間，分析TH-PL中脂肪酸的成分，并采用面積歸一化法計算相對含量。

1.3.5 細胞培養

小鼠巨噬細胞RAW264.7的培養基為DMEM完全培養基（含有體積分數10% FBS、100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素），培養于T25瓶中，每天按照休積比1∶3進行傳代。

1.3.6 TH-PL對RAW264.7細胞活性的影響

細胞活性采用MTT法測定。將對數生長期、密度為2h104個/mL的RAW264.7細胞接種于96 孔板，培養16 h。用含有TH-PL（0、12.5、25、50、100 μg/mL）的完全培養基繼續培養2 d。隨后每孔加入20 μL的MTT（5 mg/mL）孵育4 h。小心吸去全部的液體，之后加入150 μL的DMSO室溫下振蕩10 min，于490 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 TH-PL對RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響

RAW264.7細胞以2h104個/mL的密度接種于24 孔板，培養16 h。培養基隨后分別替換為正常組培養基、破骨細胞模型組培養基（含50 ng/mL RANKL）、陽性對照組培養基（含50 ng/mL RANKL和12.5 μg/mL的DHA）和TH-PL處理組培養基（含50 ng/mL RANKL和25、50、100 μg/mL的TH-PL，分別為TH-PL低、中、高劑量組），隔天換液。培養5 d后，參照TRAP試劑盒方法進行染色。將TRAP染色陽性且細胞核數目大于3的細胞記為破骨細胞，并在100 倍倒置顯微鏡下計數并拍照。

1.3.8 TH-PL對破骨細胞凋亡的影響

RAW264.7細胞以2h104個/mL的密度接種于24 孔板，培養16 h后替換為破骨細胞模型組培養基，3 d后更換為陽性對照組和TH-PL處理組培養基繼續培養2 d。隨后用胰蛋白酶消化并收集各組細胞，PBS清洗，4 ℃，1 000 r/min離心5 min，用培養基制成5h105個/mL的細胞懸液，并按照Muse? Annexin V & Dead Cell試劑盒的方法染色。

1.3.9 TH-PL對破骨細胞線粒體膜電位的影響

收集各組細胞并向中加入1 mL熒光染料Rh123溶液（5 μg/mL），37 ℃避光孵育30 min。新鮮培養基重懸細胞后加于酶標板，用熒光酶標儀測定熒光強度，激發波長為490 nm，發射波長為535 nm。

1.3.10 TH-PL對破骨細胞caspase-3蛋白表達量的影響

各培養組細胞在4 ℃裂解30 min，提取細胞中的總蛋白，隨后采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒統一各組的總蛋白濃度；調整后的蛋白樣品加入上樣緩沖液并混勻，經電泳、轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、顯色等步驟后，最后以GAPDH為內參計算caspase-3蛋白的表達量。

1.4 數據統計分析

數據表示為至少3 次測定的平均值±標準偏差。在SPSS 17.0軟件中通過單因素方差分析不同組之間的統計學顯著性。*表示差異顯著（P＜0.05）；**表示差異極顯著（P＜0.01）。使用Origin 8.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 TH-PL的硅膠柱層析分離和薄層色譜檢識

圖 1 TH-PL的硅膠柱層析圖譜（a）和Fr III的薄層色譜圖（b）Fig. 1 Silica gel column chromatography of TH-PL (a) and TLC of Fr III (b)

表 1 羅非魚頭總脂及分離組分的得率Table 1 Yield of total lipids and lipid components from tilapia heads

采用硅膠柱層析對羅非魚頭總脂進行分離，分別用氯仿、丙酮和甲醇洗脫，可獲得Fr I、Fr III和Fr III（圖1a），3 種組分得率分別為12.21%、0.75%和1.52%（表1）。Dittmer-Lester顯色劑專一地對全部磷脂顯色，顏色為藍色，而對中性脂、糖脂等化合物不顯色，如圖1b所示，Fr III在Dittmer-Lester試劑顯色下呈藍色斑點（Rf＝0.84），而Fr I和Fr II沒有呈色反應。因此，Fr III可初步鑒定為TH-PL。鄒舟等[15]分析了鰱魚頭磷脂含量為0.98%，與本實驗結果基本一致。綜上所述，TH-PL含量相對較高，這也為進一步探討TH-PL的生理活性提供了可靠的理論支持。

2.2 FTIR分析結果

圖 2 TH-PL的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 2 FTIR spectrum of TH-PL

TH-PL的紅外光譜如圖2所示，波數3 424.91 cm-1的強吸收為üOH的伸縮振動；波數3 010.54 cm-1與2 853.17 cm-1的吸收峰同時出現，表明TH-PL中既含有飽和CH，又含有不飽和的CH；波數2 922.90 cm-1和1 463.73 cm-1分別為üCH2ü和üCH3的特征吸收峰；波數1 739.20 cm-1為飽和脂肪酸中C＝O的伸縮振動特征吸收峰；波數1 648 cm-1為苯環的特征吸收峰；波數1 169.04 cm-1為üC＝OüOü的特征吸收峰（sn-1）；波數1 238.85 cm-1的強吸收峰為PO2ü的伸縮振動；波數1 061.70 cm-1為CüOüPO2ü的伸縮振動；波數969.53 cm-1為CüCüN+的特征吸收峰；波數720.59 cm-1為4 個üCH2ü所組成的長鏈的吸收峰。本實驗所得的TH-PL與文獻報道的磷脂的紅外光譜結果基本一致[16-17]，因此，本實驗進一步定性所得樣品為磷脂。

2.3 脂肪酸分析結果

表 2 TH-PL的脂肪酸組成及相對含量Table 2 Fatty acid composition and distribution of TH-PL

TH-PL的脂肪酸組成如表2所示，TH-PL中飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）約占總脂肪酸含量的34.84%，其中以C16:0（棕櫚酸）為主，其次為C18:0（硬脂酸）和C14:0（豆蔻酸），與文獻報道的在一些淡水魚和海洋生物的磷脂中存在大量的棕櫚酸相符[18-19]。單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）約占22.05%，其中以C18:1（油酸）為主，此外還含有一定量的C16:1（棕櫚油酸）。TH-PL中多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）約占總脂肪酸的38%，其中C18:2n-6（亞油酸）含量最高，其次為C22:6n-3（DHA）和C18:3n-3（亞麻酸）等。ω-3 PUFA的含量為14.15%，其中EPA較少，而DHA含量相對較多，約占總脂肪酸的7.98%。通過上述分析得知，TH-PL中PUFA的種類豐富且含量較多，有望成為良好的功能性食品原料。

2.4 TH-PL對RAW264.7細胞活性的影響

為了檢測不同質量濃度TH-PL對正常小鼠巨噬RAW264.7細胞是否具有毒性，本研究采用MTT法測定各組細胞中的活細胞數目，結果如圖3所示，與空白對照組相比，TH-PL作用RAW264.7細胞2 d時，對RAW264.7細胞幾乎無毒副作用，反而在高質量濃度下具有促進細胞增殖的作用。因此，可以排除TH-PL自身毒性對抑制破骨細胞活性實驗所產生的假陽性作用，表明0～100 μg/mL范圍內的TH-PL可用于后續的細胞實驗中。

圖 3 TH-PL對RAW264.7細胞活性的影響Fig. 3 Effect of TH-PL on the viability of RAW264.7 cells

2.5 TH-PL對RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響

采用RANKL誘導單核巨噬細胞RAW264.7分化為多核破骨細胞，結果如圖4a所示，正常組RAW 264.7培養5 d后進行TRAP染色，可見大小相對均一的單核巨噬細胞，而經50 ng/mL的RANKL誘導RAW 264.7細胞5 d后可見大量TRAP陽性的多核細胞（核不少于3 個），細胞體積明顯增大，表示在此條件下破骨細胞模型建立成功。圖4b為TRAP陽性多核細胞的計數結果，與模型組相比，隨著TH-PL質量濃度的升高，破骨細胞數量相應減少，細胞核的數量和細胞的平均直徑也明顯降低，呈現出一定的劑量依賴性。其中，100 μg/mL TH-PL具有顯著抑制RAW264.7細胞向破骨細胞分化的作用，達到了與DHA陽性對照組相似的效果。Wu Zhou[9]和Ma Hongmei[20]等研究表明，在小鼠骨髓細胞培養系統中破骨前體細胞吞噬磷脂酰絲氨酸脂質體后被抑制分化為破骨細胞；Er?s等[21]通過膠原誘導性關節炎小鼠模型實驗發現，卵磷脂對慢性關節炎的形態功能和微循環特征產生積極作用。上述研究表明了，磷脂類物質具有抑制骨質疏松的效果，與本實驗結果相符。但TH-PL的組成較為復雜，有待于進一步對其骨質疏松構效關系進行研究。

圖 4 TH-PL對RANKL誘導RAW264.7細胞分化為破骨細胞的影響Fig. 4 Effect of TH-PL on RANKL-induced differentiation of RAW264.7 cells into osteoclasts

2.6 TH-PL對破骨細胞凋亡的影響

細胞凋亡是一種程序性死亡，由細胞主動有序高度調控，是生物體內衰老細胞和損傷細胞死亡的重要方式[22]。經研究表明，破骨細胞凋亡是調節成骨細胞和破骨細胞之間動態平衡的關鍵性因素[23-24]。為了明確TH-PL對破骨細胞凋亡的作用效果，本研究以DHA為陽性對照，采用不同質量濃度的TH-PL誘導破骨細胞2 d，然后利用流式細胞儀檢測破骨細胞凋亡率，結果如圖5所示，質量濃度為50、100 μg/mL的TH-PL和DHA均可顯著促進破骨細胞的凋亡，總凋亡率分別為12.07%、24.17%、22.07%，且主要為早期凋亡（Q1）。Sakakima等[25]研究發現，磷脂酰膽堿通過誘導肝癌細胞Hep-G2的凋亡（凋亡率為3.11%），進而抑制癌細胞的生長。王亮等[26]也報道了肝源性磷脂酰乙醇胺能夠激活SMMC-7721細胞凋亡過程中關鍵性調節基因bcl-2和caspase-3的表達，從而誘發癌細胞凋亡。上述研究表明，磷脂類物質具有誘導細胞發生凋亡的效果，本研究發現TH-PL能有效促進破骨細胞的凋亡，進一步揭示了脂類物質抗骨質疏松作用的分子機理，為磷脂類物質抗骨質疏松作用的深入研究提供了參考。

圖 5 TH-PL對破骨細胞凋亡的影響Fig. 5 Effect of TH-PL on osteoclast apoptosis

2.7 TH-PL對破骨細胞線粒體膜電位及caspase-3蛋白表達量的影響

圖 6 TH-PL對線粒體膜電位（a）及細胞內caspase-3蛋白表達量（b）的影響Fig. 6 Effect of TH-PL on mitochondrial membrane potential (a) and expression of caspase-3 in osteoclasts (b)

當細胞受到各種凋亡信號的刺激后，會導致線粒體膜電位降低，呼吸鏈斷裂，進而誘導細胞凋亡[27]。研究證明，線粒體膜電位與破骨細胞凋亡密切相關[28-29]。為了明確TH-PL對破骨細胞線粒體膜電位的作用效果，本研究通過對細胞進行Rh123染色，檢測其熒光強度，以反映細胞線粒體膜電位高低。結果如圖6a所示，不同質量濃度（25、50、100 μg/mL）TH-PL干預破骨細胞后，細胞熒光強度逐漸下降，且呈劑量依賴性。當TH-PL的質量濃度為100 μg/mL時細胞線粒體膜電位下降到76.10%（與模型組相比）。為進一步探討TH-PL對破骨細胞線粒體凋亡傳導通路的影響，實驗采用Western blotting方法檢測TH-PL處理后破骨細胞中caspase-3表達量的變化情況。結果如圖6b顯示，與模型組相比，用50、100 μg/mL TH-PL干預細胞后，顯著地提高了caspase-3的表達量。Kim等[30]研究表明DHA可通過增加Bcl-2家族蛋白Bim的表達來促進成熟破骨細胞凋亡。在外界刺激作用下，Bim表達增高或活性增強后激活Bak/Bax，活化的Bak/Bax形成六聚體聚集在線粒體外膜形成孔道，導致線粒體功能紊亂，釋放細胞色素c，與凋亡酶激活因子Apaf-1、ATP結合形成的多聚體募集并活化胱天蛋白酶caspase-9，最終激活下游執行者caspase-3、caspase-7，導致細胞凋亡[31-32]。在本研究中觀察到TH-PL誘導破骨細胞凋亡，并且通過線粒體膜電位的降低，caspase-3的激活來介導該作用，因此推測，TH-PL可能是通過線粒體通路誘導破骨細胞發生凋亡，進而影響破骨細胞的活性。

3 結 論

本研究采用溶劑法提取羅非魚頭總脂，通過硅膠柱層析分離得到磷脂組分TH-PL，其占羅非魚頭干質量的1.52%；通過TLC和FTIR法鑒定確認，其具有磷脂的基本性質與結構；氣相色譜分析結果顯示，TH-PL含有豐富的PUFA，約占總脂肪酸含量的38%。采用RAW264.7細胞在體外成功建立破骨細胞模型，并利用上述模型確認TH-PL具有顯著抑制RAW264.7分化為破骨細胞的作用。進一步研究表明，TH-PL可破壞破骨細胞線粒體膜完整性，降低線粒體跨膜電位，并提高細胞內促凋亡蛋白caspase-3的表達量，從而誘導破骨細胞凋亡，當TH-PL質量濃度為100 μg/mL時，破骨細胞總凋亡率達到24.17%。

綜上所述，本研究制備的TH-PL在一定質量濃度下具有顯著抑制破骨前體細胞分化和促進破骨細胞凋亡的作用，有望成為抑制骨質疏松作用的功能性食品原料。